一种基于纳米流式检测仪检测外泌体膜完整性的方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种基于纳米流式检测仪检测外泌体膜完整性的方法及其应用，所述方法包括：（1）将Calcein

【技术实现步骤摘要】
一种基于纳米流式检测仪检测外泌体膜完整性的方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种基于纳米流式检测仪检测外泌体膜完整性的方法及其应用。

技术介绍

[0002]外泌体是细胞分泌的一种直径在30
‑
150 nm的细胞外囊泡，具有典型的脂质双分子层结构，携带有多种蛋白质、脂类、RNA等重要信息，在细胞之间的通讯和机体调控中发挥作用。脂质双分子层结构可有效保护其内容物，具有更高的稳定性，因此在外泌体的研究中外泌体脂质双分子层的研究就显得尤为重要。
[0003]外泌体作为一种新型细胞间通讯的方式，受到了科研界的广泛关注，外泌体的研究中其颗粒浓度、粒径分布、标志物鉴定等方面的研究已经非常普遍。但关于外泌体的脂质双分子膜作为保护外泌体内容物的研究却很少见。目前，对外泌体膜的研究可以采用扫描电子显微镜、原子力显微镜、透射电镜等进行研究。上述工具能够观察到外泌体的膜形态、粒径。
[0004]也有采用细胞流式仪检测外泌体膜蛋白的相关研究，但需要使用磁珠偶联后进行荧光标记，磁珠偶联效率还需要再验证，且耗材和仪器都很昂贵。检测也有采用ELISA方法进行外泌体磷脂含量检测的相关研究，但该方法只能对外泌体总磷脂进行定量分析，不能确定是外泌体内部还是外面游离的磷脂。也有通过亲脂性膜染料的方法来研究外泌体膜，但他们只能分析出外泌体中有膜部分的比例，也无法区分外泌体膜的通透性。也有一些报道使用细胞流式的方法来检测细胞外囊泡膜的完整性，但细胞流式散射光的检测极限通常是200
‑
>500 nm，不适用于外泌体（30
‑
150nm）的检测。因此，针对现有技术存在的问题，开发一种快速、准确检测外泌体膜完整性的方法具有重要的应用价值。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种基于纳米流式检测仪检测外泌体膜完整性的方法及其应用。本专利技术所述方法在评估外泌体的稳定性方面具有重要应用价值，特别是评估外泌体在不同条件下的完整性具有广泛的适用性。
[0006]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供一种基于纳米流式检测仪检测外泌体膜完整性的方法，所述方法包括：
[0008]（1）将Calcein
‑
AM与外泌体混合后并孵育；
[0009]（2）将孵育后的混合液加入排阻柱，洗脱，收集流出液；
[0010]（3）采用纳米流式检测仪检测流出液，根据荧光比例计算外泌体样品中膜完整的外泌体的比例。
[0011]本专利技术提供了一种快速、准确检测外泌体膜完整性的方法。本专利技术中采用
Calcein
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AM通过流式细胞术检测完整的细胞外囊泡，Calcein
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AM本身不发光，有一定的疏水性，能够轻易穿过外泌体脂质膜，一旦进入外泌体内，Calcein
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AM会被外泌体内的酯酶剪切成膜非渗透性的极性分子Calcein，再通过排阻柱方法去除多余的Calcein
‑
AM试剂，进行纳米流式检测，若外泌体完整性良好即可被滞留在外泌体内并发出强绿色荧光，反之，则会从外泌体中泄露出来。
[0012]优选地，步骤（1）中，所述Calcein
‑
AM与外泌体混合得到的混合液中，所述Calcein
‑
AM的浓度为450
‑
550μM。
[0013]本专利技术中，通过调节Calcein
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AM在混合液中的浓度来使试剂与外泌体充分反应，Calcein
‑
AM的浓度为450
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550μM范围时，能够与外泌体充分反应，具有较高的外泌体内酯酶酶解的速率。
[0014]优选地，步骤（1）中，所述Calcein
‑
AM与外泌体混合得到的混合液中，所述混合液中外泌体的颗粒浓度大于1.0E+10 Particles/mL。
[0015]优选地，步骤（1）中，所述孵育的温度为30
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55℃；所述孵育的时间为0.8
‑
2h。
[0016]优选地，步骤（1）中，所述孵育的温度为30
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37℃；所述孵育的时间为0.8
‑
2h。
[0017]本专利技术中，步骤（1）中，所述孵育的温度为30
‑
55℃，考虑到温度越高对外泌体的形态、大小、浓度及内容物的功能等可能会有一定的影响，故优选地，将步骤（1）中，所述孵育的温度调整为30
‑
37℃对外泌体自身更加友好。
[0018]本专利技术中，可通过调整孵育的温度、时间、试剂的使用浓度等几方面来增加酯酶酶解的反应速率，通过控制孵育时间同时考虑温度变化来增加酯酶酶解的反应速率。本专利技术中控制孵育的温度为30
‑
37℃，孵育的时间为0.8
‑
2h，在这个范围内时，具有较高的反应速率，检测结果更准确。
[0019]优选地，步骤（2）中，所述排阻柱的填料为Sepharose
®ꢀ
CL
‑
2B。
[0020]本专利技术中，所述填料为Sepharose
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CL
‑
2B，与NW Rose Viral L填料（厂家：纳微科技）对比，CL
‑
2B填料有非特异性吸附低（NW Rose Viral L填料始终有杂蛋白等物质截留在填料最上方，而Sepharose
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CL
‑
2B填料非特异吸附低）、回收率高（Sepharose
®ꢀ
CL
‑
2B回收率65%，NW Rose Viral L回收率56%）、重复性好（见图33：Sepharose
®ꢀ
CL
‑
2B RSD为4.6%，见图34：NW Rose Viral L RSD为21.3%）、可用有机溶剂及1~2mol/L 的NaOH在位清洗等优势。
[0021]优选地，步骤（2）中，所述混合液与填料的体积比为(90
‑
110)μL:5 mL。
[0022]优选地，步骤（2）中，所述洗脱的具体步骤包括：将混合液加入排阻柱，待样品全部进入排阻柱内，底部出口无液体流出后，分次加入与混合液等体积的缓冲液洗脱，第15
‑
23次洗脱时，收集并合并流出液。
[0023]优选地，所述缓冲液为PBS缓冲液。
[0024]优选地，步骤（3）中，所述计算外泌体样品中膜完整的外泌体的比例的方法包括：
[0025]外泌体样品中膜完整的外泌体的比例=纳米流式检测仪检测外泌体的荧光颗粒数/纳米流式检测仪检测外泌体的总颗粒数
×
100%
[0026]其中，总颗粒数=荧光颗粒数+散射光颗粒数。
[002本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于纳米流式检测仪检测外泌体膜完整性的方法，其特征在于，所述方法包括：（1）将Calcein
‑
AM与外泌体混合后并孵育；（2）将孵育后的混合液加入排阻柱，洗脱，收集流出液；（3）采用纳米流式检测仪检测流出液，根据荧光比例计算外泌体样品中膜完整的外泌体的比例。2.根据权利要求1所述的基于纳米流式检测仪检测外泌体膜完整性的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述Calcein
‑
AM与外泌体混合得到的混合液中，所述Calcein
‑
AM的浓度为450
‑
550 μM。3.根据权利要求1所述的基于纳米流式检测仪检测外泌体膜完整性的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述Calcein
‑
AM与外泌体混合得到的混合液中，所述混合液中外泌体的颗粒浓度大于1.0E+10 Particles/mL。4.根据权利要求1所述的基于纳米流式检测仪检测外泌体膜完整性的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述孵育的温度为30
‑
55℃；所述孵育的时间为0.8
‑
2h。5.根据权利要求1所述的基于纳米流式检测仪检测外泌体膜完整性的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述排阻柱的...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜宝多，张文辉，王建武，吴成恩，
申请(专利权)人：北京恩康医药有限公司，
类型：发明
国别省市：