一种基于HPLC-SEC的外泌体检测方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种基于HPLC

【技术实现步骤摘要】
一种基于HPLC
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SEC的外泌体检测方法及其应用


[0001]本专利技术属于检测分析
，具体涉及一种基于HPLC
‑
SEC的外泌体检测方法及其应用。

技术介绍

[0002]外泌体（Exosome）是指各类生物体分泌的、脂膜包裹的、含有各类核酸和蛋白质等生物分子的囊泡（30
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150 nm）。目前，被广泛接受的分离外泌体的技术包括尺寸排阻色谱（Size
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exclusion chromatography，SEC），尺寸排阻色谱基于分子大小实现分离目的，该技术利用了填充多孔聚合物微球或硅胶微球的色谱柱，使被分离物质通过色谱柱，粒径小的分子可以进入微球的内部孔隙，流出色谱柱需要更长时间；大分子则从色谱柱中更早洗脱，从而达到大小分子分离的目的。利用这一分离原理将尺寸排阻色谱应用到外泌体的分析中，可将外泌体与其他杂质进行分离后，对外泌体进行准确定量。
[0003]外泌体属于磷脂双分子层包裹的胞外囊泡，紫外光谱吸收较弱，紫外检测外泌体的局限性对外泌体的质量分析造成很大的困难，有专利报道可以通过外泌体的自发荧光进行检测。
[0004]目前国外CODIAK BIOSCIENCES公司发表过两篇关于荧光检测分析外泌体的专利（专利号：WO2019/246591A1和US2020/0025685A1）。CODIAK BIOSCIENCES公司发表的第一篇专利（WO2019/246591A1）的主要内容包括：采用液相色谱结合SEC柱进行外泌体特征波长扫描，采用的色谱柱为：ACCLAIM SEC
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1000色谱柱，扫描波长中包含ex280 nm/em350 nm。
[0005]CODIAK BIOSCIENCES公司发表的第二篇专利（US2020/0025685A1）的主要内容包括：采用阴离子交换色谱（AEX）结合荧光对Optiprep（碘克沙醇密度梯度离心）纯化的外泌体进行荧光扫描，确定最佳荧光检测波长，最终确定ex556 nm/em573 nm为最佳检测荧光。采用荧光检测器对细胞收获液中外泌体的产量进行分析，同时采用二维液相色谱对经过密度梯度离心纯化的、HEK293F来源的外泌体进行分析，二维液相为SEC结合AEX，所使用的SEC分析色谱柱为TOSOH公司的TSKgel G4000SW
XL
（硅胶柱），流速为0.8 mL/min。
[0006]CN115541777A公开了一种基于二维液相评价外泌体纯度的方法，通过二维液相色谱仪采用尺寸排阻法和离子交换色谱法结合的方法来评价外泌体纯度；样品首先进入液相色谱仪第一维的尺寸排阻色谱柱，采用第一维液相的流动相等度洗脱，使外泌体进行首次分析；再通过切换液相色谱仪的六通阀，对外泌体主峰部分进行中心切割进入第二维的离子色谱柱对其进行捕捉收集，通过第二维的流动相梯度洗脱进入检测器进行第二次分析。
[0007]外泌体作为一种新型细胞间通讯的方式，受到了科研和医药产业界的广泛关注，涌现出众多利用外泌体固有特性和优势进行临床诊断、药物开发的研究和市场应用。随着研究的不断深入，需要科学的外泌体评价分析方法。当前基于外泌体颗粒浓度、粒径分布的检测方法无法准确辨别溶液中所含的其他杂质，例如游离的蛋白质、核酸等。HPLC
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SEC可以实现外泌体的纯度分析，但常规的HPLC
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SEC方法存在一定的局限性。首先，现有的采用紫外检测器分析外泌体的方法灵敏度较低，检测时对样品浓度要求较高；其次，外泌体样品中含
有较多杂质，需要开发和优化使杂质与外泌体分离效果更好的分析方法；第三，由于外泌体的特殊脂膜结构，容易非特异吸附于色谱柱。因此降低吸附、提高收率、提高色谱柱的使用寿命，是开发新的分析技术的重点。
[0008]综上所述，开发一种快速、准确、高灵敏度的基于HPLC
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SEC的外泌体定量方法具有重要的应用价值。

技术实现思路

[0009]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种基于HPLC
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SEC的外泌体检测方法及其应用。所述检测方法可快速准确地对外泌体进行定量检测，对不同来源的外泌体、不同工艺过程样品、原液和制剂成品中的外泌体都能实现精确检测；所述方法还能够使外泌体与杂蛋白、核酸的分离度更高，检测效果更好；本专利技术采用的流动相可降低色谱柱对外泌体的非特异性吸附作用，同时使用一定比例的有机试剂对色谱柱进行处理，延长了色谱柱的使用寿命。本专利技术所述检测方法具有特异性、可操作性，对外泌体的质量鉴别分析具有重要意义。
[0010]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0011]第一方面，本专利技术提供一种基于HPLC
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SEC的外泌体检测方法，所述检测方法包括：
[0012]（1）采用全波长扫描外泌体样品，获得最佳荧光检测波长为ex280 nm/em573 nm；
[0013]（2）采用尺寸排阻色谱对外泌体样品进行分离和检测；检测所用的检测器包括紫外检测器、荧光检测器或多角度静态光散射检测器中任意一种或至少两种的组合；
[0014]所述流动相由基础流动相和解吸附试剂组成；
[0015]所述解吸附试剂选自盐酸精氨酸（Arg
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HCl）或泊洛沙姆188（Poloxamer 188，P188）。
[0016]本专利技术通过Waters HPLC的荧光检测器和怀雅特（WYATT）多角度静态光散射器进行特异性识别，利用SEC分离外泌体，开发外泌体的定量及定性方法，并对不同来源的胞外囊泡进行测试，所述检测方法具有特异性、可操作性，对外泌体的质量鉴别分析具有重要意义。
[0017]本专利技术中所述方法进行实验分析需要采用几种检测器进行单独使用或者组合使用，从而提高检测的效率，包括将紫外检测器、荧光检测器或多角度静态光散射检测器任意一种单独使用；或者将紫外检测器与荧光检测器的组合使用；或将紫外检测器和多角度静态光散射检测器的组合，或者三者同时使用。
[0018]本专利技术所述检测方法可快速准确地对外泌体进行定量及定性检测，通过荧光扫描获得高灵敏度分析波长；通过色谱柱的筛选获得分离效果最佳的色谱柱，通过参数优化使该检测方法更加稳定；所述检测方法可用于不同组织或细胞来源外泌体原液含量的检测，所述方法也同样适用于细胞样品、工艺过程样品和制剂成品中外泌体含量的检测；所述方法能够精确检测到成品中外泌体的含量，并进一步提高了外泌体与杂蛋白、核酸的分离度；同时所述方法对分析用流动相进行了优化，可降低色谱柱对外泌体的非特异性吸附作用；检测后使用一定比例的表面活性剂对色谱柱进行处理，延长了色谱柱的使用时间；经过对所述方法的方法学验证分析，结果表明本专利技术开发的检测外泌体的方法符合方法学验证的相关要求，在外泌体质量控制中具有重要的应用价值。
[0019]优选地，所述基础流动相为添加了氯化钠的磷酸盐缓冲液。
[0020]优选地，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于HPLC
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SEC的外泌体检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：（1）采用全波长扫描外泌体样品，获得最佳荧光检测波长为ex280 nm/em573 nm；（2）采用尺寸排阻色谱对外泌体样品进行分离和检测；检测所用的检测器包括紫外检测器、荧光检测器或多角度静态光散射检测器中任意一种或至少两种的组合；检测所用的流动相由基础流动相和解吸附试剂组成；所述解吸附试剂选自盐酸精氨酸或泊洛沙姆188。2.根据权利要求1所述的基于HPLC
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SEC的外泌体检测方法，其特征在于，所述基础流动相为添加了氯化钠的磷酸盐缓冲液；所述基础流动相中磷酸盐缓冲液的浓度为100
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200 mM；所述基础流动相中氯化钠的浓度为20
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300 mM；所述流动相的pH值为7.0
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8.0。3.根据权利要求1或2所述的基于HPLC
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SEC的外泌体检测方法，其特征在于，所述解吸附试剂为盐酸精氨酸时，所述流动相中盐酸精氨酸的浓度为30
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80 mM。4.根据权利要求1或2所述的基于HPLC
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SEC的外泌体检测方法，其特征在于，所述解吸附试剂为泊洛沙姆188时，所述流动相中泊洛沙姆188的浓度为0.1
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0.3% (w/v)。5.根据权利要求1
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4中任一项所述的基于HPLC
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SEC的外泌体检测方法，其特征在于，检测所用的检测器为紫外检测器和荧光检测器的组合；或检测所用的检测器为紫外检测器和多角度静态光散射检测器的组合；采用紫外检测器进行检测时，检测波长设置为UV280 nm和UV260 nm；采用荧光检测器进行检测时，荧光检测器设置波长为ex280 nm/...

【专利技术属性】
技术研发人员：李凌俐，张文辉，王建武，李志，陈静，
申请(专利权)人：北京恩康医药有限公司，
类型：发明
国别省市：