【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及g蛋白信号转导途径在赤霉素合成调控中的应用。
技术介绍
1、赤霉素是一种广泛存在于植物中的内源性生长调节剂，参与植物生长发育的多个生物学过程，对植物的生长发育有重要的调控作用。迄今为止，从各类生物里发现的赤霉素已达136种，目前只有属于自由型的ga1、ga3、ga4和ga7等少数几种赤霉素具有较强的生理活性，其中ga3和ga4+7是两种主要的商业产品，在水果、蔬菜和谷物种植中被广泛用作生长调节剂。目前，赤霉素的工业生产主要依赖于藤仓赤霉菌(fusariumfujikuroi)的液体发酵。该菌种最早是作为一种水稻致病菌被分离发现，可以导致水稻过度生长引发恶苗病。此外，一些镰刀菌属的菌种，如串珠镰刀菌，以及曲霉属的菌种，如黑曲霉，也具有合成赤霉素的潜力。在工业生产中，具有稳定性和高产量的菌株至关重要。过去十年，赤霉素生物合成途径已完全被揭示，同时也开发出了较多基因工程菌。然而，大多数研究仍限于实验室菌株，当前应用于工业的菌株多来自数十年前的随机诱变筛选。
2、作为应用最广的赤霉素，ga3主要通过藤仓赤霉菌的液体深层发酵获得，而生产效价较低。因此，对生产菌株进行合理改良，开发得到一株高产赤霉素ga3的菌株对其工业生产具有重要意义。
3、在另一方面，感染禾谷镰刀菌、藤仓赤霉菌、串珠镰孢菌等真菌的植株，如水稻、小麦、玉米等，会出现疯长现象，病株比正常植株高出50％以上，结实率明显降低，伴有枯黄症状，称为"恶苗病"或"赤霉病"。其主要原因在于植物病菌产生过量的赤霉素导致植物生长素异常增加，
技术实现思路
1、为了合理调控丝状真菌中赤霉素的生产，本专利技术对丝状真菌中g蛋白信号转导途径进行了研究，提出了一种利用g蛋白偶联受体信号转导通路调控赤霉素合成的方法。该应用方法具体包括两种操作方向，可分别提高或降低丝状真菌中的赤霉素的合成，以适应于不同的应用场景，为高产赤霉素工程菌株的构建或防治植物赤霉病药物的制备提供了可行的路线。
2、本专利技术采用的技术方案是：g蛋白信号转导途径在赤霉素合成调控中的应用，其特征在于，所述g蛋白信号传导途径包括：以g蛋白偶联受体为感受器；以异源三聚体g蛋白、腺苷酸环化酶为信号放大器；以camp为第二信使，激活与赤霉素的合成相关的蛋白激酶a。
3、作为优选，所述应用包括：使g蛋白偶联受体gpr1缺失，以降低丝状真菌中赤霉素的合成。
4、作为优选，所述应用包括：激活所述异源三聚体g蛋白中亚基gpa2，以提高丝状真菌中赤霉素的合成。
5、作为优选，所述丝状真菌包括禾谷镰刀菌、串珠镰孢菌、藤仓赤霉菌在内的具有赤霉素合成能力的丝状真菌。
6、g蛋白信号转导途径(g protein signal transductionpathway，gpstp)普遍存在于原核和真核生物中，该系统感应细胞外环境的刺激并将其传递到细胞内并导致细胞生理状态的改变。典型的gpstp由g蛋白偶联受体(gpcr)、由gα、gβ、gγ亚基组成的异三聚体g蛋白以及下游效应器组成。请参考图1，首先，gpcr接受外界刺激，如光、神经递质、激素、营养因子、气味分子等，随后异源三聚体g蛋白响应受配体激活的gpcr。异源三聚体g蛋白的β、γ亚基紧密的结合在一起，再与具有gtp酶活性的α亚基结合。当刺激信号传递给g蛋白时，结合α亚基上的gdp被磷酸化形成gtp，同时α亚基与β-γ亚基复合体分离并作用于不同的效应器上，如腺苷酸环化酶(ac)、磷脂酶、ca2+，k+通道等。被α亚基激活的其中一个典型的效应器为膜上的腺苷酸环化酶，可将atp环化形成第二信使camp，camp进一步激活蛋白激酶a(pka)。在藤仓赤霉菌中，pka由两个相同的调节亚基和两个不同的催化亚基(pka1和pka2)构成，具有camp依赖性；其中，pka1与藤仓赤霉菌中比卡菌素的合成相关，而pka2与赤霉素的合成相关。由此，本专利技术基于丝状真菌中对赤霉素的生物合成中起着关键作用的camp-pka信号通路的关键上游信号通路gpcr-gα-ac信号转导途径展开研究。
7、研究发现，利用g蛋白偶联受体信号传导通路调控赤霉素产量的方法具体可包括两种操作方向：(1)使g蛋白偶联受体编码基因gpr1的表达降低或缺失，以降低丝状真菌中赤霉素的合成。gpcr具有7个跨膜结构域，可以接受外界物理、化学刺激并向下游传导的膜蛋白。本专利技术针对gpcr中的跨膜蛋白gpr1的编码基因gpr1进行了基因编辑，使其表达降低或缺失，最终降低了藤仓赤霉菌赤霉素合成能力，可进一步作用于藤仓赤霉菌导致的包括水稻、小麦、玉米、甘蔗等经济作物减产、死亡等一系列问题。(2)激活所述异源三聚体g蛋白中的亚基gpa2，以提高丝状真菌中赤霉素的合成。异源三聚体g蛋白中的α亚基一般包括三种类型，分别为gpa1、gpa2、gpa3。本专利技术对所述途径中gpa2进行组成型激活，使通路信号传递水平加强，提升赤霉素产量，进而作用于赤霉素工业发酵生产中。
8、基于上述发现，本专利技术提出了g蛋白偶联受体gpr1作为丝状真菌药物靶标蛋白在制备防治植物赤霉病的药物中的应用。例如针对该靶标蛋白位点设计的crispr、sirna等，使gpr1基因表达降低或缺失；或通过药物筛选获得抑制gpr1蛋白活性的抑制剂等方法，最终降低赤霉素的产量，进一步可降低赤霉素作用于包括水稻、小麦、玉米、甘蔗等的经济作物引发减产、死亡等一系列问题。
9、作为优选，所述应用包括：针对所述g蛋白偶联受体gpr1的编码基因设计使其表达缺失或降低的抑制剂药物。所述g蛋白偶联受体gpr1的氨基酸序列如seq id no.1所示。
10、基于上述发现，本专利技术还提供了一种异源三聚体g蛋白突变体，所述突变体是将氨基酸序列如seq id no.2所示的异源三聚体g蛋白亚基gα的第204位谷氨酰胺突变为亮氨酸获得的。对异源三聚体g蛋白中gpa2类型的α亚基进行了定点突变，所获得的突变体具有了结构性激活的α亚基，使其始终处于组成型激活态，并持续激活腺苷酸环化酶合成camp，通路信号传递水平得到加强，提升了赤霉素产量。
11、基于上述的异源三聚体g蛋白突变体，本专利技术还提供了含有所述的异源三聚体g蛋白突变体编码基因的基因工程菌。需要说明的是，本专利技术所述的基因工程菌的宿主包括上述的丝状真菌，或具有合成赤霉素能力的菌株。
12、本专利技术还提供了含有所述异源三聚体g蛋白突变体编码基因的基因工程菌在微生物发酵制备赤霉素中的应用。
13、作为优选，所述的应用包括：将含异源三聚体g蛋白突变体编码基因的基因工程菌接种至发酵培养基，25～30℃、200～300rpm本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.G蛋白信号转导途径在赤霉素合成调控中的应用，其特征在于，所述G蛋白信号传导途径包括：
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：使G蛋白偶联受体Gpr1缺失，以降低丝状真菌中赤霉素的合成。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：激活所述异源三聚体G蛋白中亚基Gpa2，以提高丝状真菌中赤霉素的合成。
4.G蛋白偶联受体Gpr1作为丝状真菌药物靶标蛋白在制备防治植物赤霉病的药物中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用包括：针对所述G蛋白偶联受体Gpr1的编码基因设计使其表达缺失或降低的抑制剂药物。
6.如权利要求2～5任一所述的应用，其特征在于，所述丝状真菌包括禾谷镰刀菌、串珠镰孢菌、藤仓赤霉菌在内的具有赤霉素合成能力的丝状真菌。
7.一种异源三聚体G蛋白突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的异源三聚体G蛋白亚基Gα的第204位谷氨酰胺突变为亮氨酸获得的。
8.含有权利要求7所述的异源三聚体G蛋白突变体编码基因的基因
9.如权利要求8所述的含有异源三聚体G蛋白突变体编码基因的基因工程菌在微生物发酵制备赤霉素中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的应用包括：将含异源三聚体G蛋白突变体编码基因的基因工程菌接种至发酵培养基，25～30℃、200～300rpm条件下发酵培养12～48h，获得含赤霉素的发酵液。
...【技术特征摘要】
1.g蛋白信号转导途径在赤霉素合成调控中的应用，其特征在于，所述g蛋白信号传导途径包括：
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：使g蛋白偶联受体gpr1缺失，以降低丝状真菌中赤霉素的合成。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：激活所述异源三聚体g蛋白中亚基gpa2，以提高丝状真菌中赤霉素的合成。
4.g蛋白偶联受体gpr1作为丝状真菌药物靶标蛋白在制备防治植物赤霉病的药物中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用包括：针对所述g蛋白偶联受体gpr1的编码基因设计使其表达缺失或降低的抑制剂药物。
6.如权利要求2～5任一所述的应用，其特征在于，所述丝状...
【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，岑宇科，李江涛，李明涵，王远山，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。