【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物的诊断技术，特别是涉及一种a型塞内卡病毒抗体重组基因和重组蛋白，以及其制备方法，由其制备的快速检测胶体金试纸条和其制备方法。
技术介绍
1、a型塞内卡病毒(senecavirus a,sva)属小rna病毒科(picornaviridae))塞内卡病毒属(senecavirus)。该病毒于2002年由美国遗传治疗公司的科研人员在病毒培养的污染物中发现，sva原型毒株svv-001被成功分离和鉴定，因其具有溶瘤特性而被应用于人类癌症的治疗。早期的sva分离株对猪无明显的致病性。近几年发现，sva与猪发生原发性水疱病(pivd)和流行性新生儿暂时性死亡(epidemic transient neonatal losses,etnl)等新病原相关。目前，sva主要感染猪，不同性别、年龄阶段均易感。感染猪临床表现为跛行，水疱并伴有精神沉郁、厌食，新生仔猪(7日龄以内)死亡率高达30％～70％，偶尔伴有腹泻症状。2014年以来，多个国家报道了sva感染所致的pivd病例。我国于2015年在广东省某猪场首次报道sva感染，随后在湖北、黑龙江、河南、福建和广东等多地陆续出现sva感染病例，引起业界对该病危害的高度关注。
2、目前，sva呈零星、局部地区流行，其传播机制仍不明确。作为新发猪传染病病原，目前还没有有效疫苗或特定的治疗方法可用于sva感染。当前，对于该病的检测无相关标准，检测方法包括病毒分离培养，实时荧光定量聚合酶链式反应，酶联免疫吸附试验等。但存在操作时间长，过程复杂，需要专业的操作人员及专门的仪器设
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，为此，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种a型塞内卡病毒vp2重组蛋白及其编码基因，本专利技术同时提供了a型塞内卡病毒vp2重组蛋白的制备方法，该重组蛋白适宜于胶体金试纸检测体系的构建，可有效检测猪血清中的抗体，用于sva感染的抗体的诊断。
2、本专利技术所要解决的第二个技术问题在于提供一种a型塞内卡病毒抗体快速检测胶体金试纸条，具有特异性强、敏感性好、重复率高、检测结果准确的优势，适用于大规模应用的现地检测方法的快速检测；
3、本专利技术所要解决的第三个技术问题在于提供一种a型塞内卡病毒抗体快速检测胶体金试纸条的制备方法。
4、本专利技术提供了一种a型塞内卡病毒vp2重组蛋白的编码基因，其核苷酸序列如seqid no：3所示。
5、本专利技术提供了一种a型塞内卡病毒vp2重组蛋白，其氨基酸序列如seq id no：4所示。
6、本专利技术还提供了一种a型塞内卡病毒vp2重组蛋白的制备方法，包括如下步骤
7、1)设计引物和pcr扩增：
8、利用a型塞内卡病毒vp2序列设计并合成一对引物的两条引物序列，以制备的a型塞内卡病毒cdna为模板进行pcr扩增，引物序列如下：
9、vp2-f1：5-cgggatccatggcatcaggaggagctt-3，seq id no.1；
10、vp2-r1：5-acgcgtcgacgggtactgtaacgcagcac-3，seq id no.2；
11、按pcr扩增试剂的要求配置体系进行pcr扩增，98℃热启动5分钟，98℃变性10秒，60℃退火5秒，68℃延伸10秒，循环40次，最后68℃延伸5分钟；
12、最后获得最终pcr扩增产物；
13、2)原核表达载体的构建及诱导表达：
14、将最终pcr扩增产物利用胶回收试纸条回收，用bamh i和sal i双酶切pet28a质粒和最终pcr扩增产物，然后相连接转化至bl21感受态细胞，挑取单克隆菌落，扩繁后加入1mm的iptg中于16摄氏度摇床进行低温诱导表达；
15、3)重组蛋白的纯化：
16、将培养基以8000g离心力离心5分钟收集菌液，加入7ml的pbs重悬；超声破碎至菌液清澈，再以8000g离心力离心5分钟收集上清液，最后上清液通过镍柱分离纯化目的蛋白。
17、本专利技术还公开了所述a型塞内卡病毒vp2重组蛋白用于制备检测a型塞内卡病毒的胶体金试纸条的用途。
18、本专利技术还公开了一种a型塞内卡病毒抗体快速检测胶体金试纸条，检测试纸设置有反应区，该反应区上设置有金标垫、c线和t线，所述金标垫上吸附有金标蛋白溶液，该金标蛋白溶液含有胶体金标记的权利要求2所述的a型塞内卡病毒vp2重组蛋白，t线为protein a重组蛋白，c线为抗a型塞内卡病毒vp2重组蛋白多克隆兔血清。
19、sva与口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,fmdv)fmdv属于同病毒科成员，且引起的临床症状相似。本专利技术的目的是针对目前临床表现无法区分sva和fmdv感染对猪群免疫工作造成一定的影响，以及缺乏有效现场可使用的检测试纸条的现状，提供快速检测的胶体金试纸条，降低检测成本，能大规模应用的现地检测方法。
20、优选地，所述金标蛋白溶液含有20％金标蛋白，t线布置为浓度为4mg/ml的protein a重组蛋白，c线布置为浓度为2mg/ml的抗a型塞内卡病毒vp2重组蛋白多克隆兔血清。
21、优选地，所述抗a型塞内卡病毒vp2重组蛋白多克隆兔血清，为a型塞内卡病毒vp2重组蛋白免疫新西兰大白兔后收集兔血清，再通过辛酸-硫酸铵沉淀法纯化处理获得的兔血清。
22、优选地，所述防腐剂包括苯甲醇、苯甲酸、水杨酸、硼酸、山梨酸、尼铂金中为1,2-己二醇、乙基己基甘油及对羟基苯乙酮的一种或几种。
23、本专利技术还提供一种上述a型塞内卡病毒抗体快速检测胶体金试纸条的制备方法，在pvc板的两端分别布置样品垫和吸水垫，样品垫和吸水垫之间布置硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上从样品垫到吸水垫方向依次布置金标垫、t线和c线，金标垫上吸附1:5稀释的金标蛋白溶液，硝酸纤维素膜的封闭条件为1h；
24、试纸条的t线布置为浓度为4mg/ml的protein a重组蛋白，c线布置为浓度为2mg/ml的抗a型塞内卡病毒vp2重组蛋白多克隆兔血清。
25、优选地，所述金标蛋白溶液的制备步骤包括：每1ml胶体金溶液加入12μl浓度为0.2mol/l的k2co3溶液及10μg的经镍柱分离纯化制备获得的a型塞内卡病毒vp2重组蛋白，加入10％的牛血清蛋白溶液使其终浓度为1％，继续搅拌振荡之后，静置，通过差速离心，收集金标蛋白，用缓冲液溶解获得金标蛋白溶液。
26、优选地，所述胶体金溶液的制备步骤包括：将5ml浓度为1％的haucl4，迅速加入500ml煮沸的水中，加入柠檬酸钠0.1125g，继续加热5分钟，调低转速，使溶液自然冷却后本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种A型塞内卡病毒VP2重组蛋白的编码基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示。
2.一种A型塞内卡病毒VP2重组蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
3.一种A型塞内卡病毒VP2重组蛋白的制备方法，其特征在于：包括如下步骤1)设计引物和PCR扩增：
4.一种A型塞内卡病毒抗体快速检测胶体金试纸条，其特征在于：检测试纸设置有反应区，该反应区上设置有金标垫、C线和T线，所述金标垫上吸附有金标蛋白溶液，该金标蛋白溶液含有胶体金标记的权利要求2或3制备的所述的A型塞内卡病毒VP2重组蛋白，T线为protein A重组蛋白，C线为抗A型塞内卡病毒VP2重组蛋白多克隆兔血清。
5.根据权利要求4所述的一种A型塞内卡病毒抗体快速检测胶体金试纸条，其特征在于：所述金标蛋白溶液含有20％金标蛋白，T线布置为浓度为4mg/ml的protein A重组蛋白，C线布置为浓度为2mg/ml的抗A型塞内卡病毒VP2重组蛋白多克隆兔血清。
6.根据权利要求4所述的A型塞内卡病毒抗体快速检测胶体金试纸条，其
7.权利要求4-6任一所述的A型塞内卡病毒抗体快速检测胶体金试纸条的制备方法，其特征在于：
8.根据权利要求7所述的A型塞内卡病毒抗体快速检测胶体金试纸条的制备方法，其特征在于：所述金标蛋白溶液的制备步骤包括：每1ml胶体金溶液加入12μl浓度为0.2mol/L的K2CO3溶液及10μg的经镍柱分离纯化制备获得的A型塞内卡病毒VP2重组蛋白，加入10％的牛血清蛋白溶液使其终浓度为1％，继续搅拌振荡之后，静置，通过差速离心，收集金标蛋白，用缓冲液溶解获得金标蛋白溶液。
9.根据权利要求8所述的A型塞内卡病毒抗体快速检测胶体金试纸条的制备方法，其特征在于：所述胶体金溶液的制备步骤包括：将5ml浓度为1％的HAuCl4，迅速加入500ml煮沸的水中，加入柠檬酸钠0.1125g，继续加热5分钟，调低转速，使溶液自然冷却后封存。
10.权利要求4-6任一所述的A型塞内卡病毒抗体快速检测胶体金试纸条在制备用于检测A型塞内卡病毒抗体的检测用品中的应用，其特征在于：在加样孔内加入稀释后的待检血清样本，静置后如果若T线和C线均呈现红色，表明待检血清样本中含有A型塞内卡病毒抗体；如果只有C线呈现红色，表明检测样品中不含有A型塞内卡病毒抗体。
...【技术特征摘要】
1.一种a型塞内卡病毒vp2重组蛋白的编码基因，其特征在于：其核苷酸序列如seq idno：3所示。
2.一种a型塞内卡病毒vp2重组蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如seq id no：4所示。
3.一种a型塞内卡病毒vp2重组蛋白的制备方法，其特征在于：包括如下步骤1)设计引物和pcr扩增：
4.一种a型塞内卡病毒抗体快速检测胶体金试纸条，其特征在于：检测试纸设置有反应区，该反应区上设置有金标垫、c线和t线，所述金标垫上吸附有金标蛋白溶液，该金标蛋白溶液含有胶体金标记的权利要求2或3制备的所述的a型塞内卡病毒vp2重组蛋白，t线为protein a重组蛋白，c线为抗a型塞内卡病毒vp2重组蛋白多克隆兔血清。
5.根据权利要求4所述的一种a型塞内卡病毒抗体快速检测胶体金试纸条，其特征在于：所述金标蛋白溶液含有20％金标蛋白，t线布置为浓度为4mg/ml的protein a重组蛋白，c线布置为浓度为2mg/ml的抗a型塞内卡病毒vp2重组蛋白多克隆兔血清。
6.根据权利要求4所述的a型塞内卡病毒抗体快速检测胶体金试纸条，其特征在于：所述抗a型塞内卡病毒vp2重组蛋白多克隆兔血清，为a型塞内卡病毒vp2重组蛋白免疫新西兰大白兔后收集兔血清，再通过辛酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：张红丽，孙仁杰，黄靖，张传亮，王雅婷，孙冰冰，柴娟，孙思琪，
申请(专利权)人：浙江省动物疫病预防控制中心浙江省兽药饲料监察所，
类型：发明
国别省市：
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