【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，涉及山羊klf6基因作为调控前体脂肪细胞分化的靶标基因的应用。
技术介绍
1、基因是一种资源，基因工程研究的基本任务是开发人们需要的基因产物，这样的基因统称为目的基因。获得目的基因的途径很多，主要是通过构建基因组文库或cdna文库，从中筛选出需要的基因。广泛使用pcr技术直接从某生物基因组中扩增出目的基因。对于较小的目的基因也可用人工化学合成。已获得的目的基因大致可分为三大类：第一类是与医药相关的基因；第二类是抗病虫害和恶劣生境的基因；第三类是编码具有营养价值的蛋白或多肽的基因。
2、基因工程技术具体指重组dna技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建(即重组dna技术)；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化。基因工程利用重组技术，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸(基因)进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内进行无性繁殖，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新的生物表型。一个完整的、用于生产目的的基因工程技术程序包括的内容有：(1)外源目的基因的分离、克隆以及目的基因的结构与功能研究；(2)适合转移、表达载体的构建或目的基因的表达调控结构重组；(3)外源基因的导入；(4)外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测与转基因生物的筛选；(5)外源基因表达产物的生理功能的核实；(6)转基因新品系的选育和建立，以及转基因新品系的效益分析；(7)生态
3、肌内脂肪(imf)含量对山羊肉质及羊肉风味有很重要的影响，具有丰富肌内脂肪的羊肉产品逐渐受到消费市场青睐。前体脂肪细胞是脂肪细胞的一种，由多能干细胞(msc)或胚胎干细胞(esc)分化而来。前体脂肪细胞体积小、呈梭形，并且间质少、胞浆内不含脂滴，但具有向胞浆内聚集脂滴的能力，在体内和体外都可以分裂增殖。前体脂肪细胞通过在胞浆内聚集脂滴而分化为成熟的脂肪细胞，并且前体脂肪细胞分化是脂肪细胞脂质蓄积的过程，是影响动物脂肪沉积的途径之一，此生物学过程涉及诸多激素分泌和基因表达的相互调控，例如ccaat增强子结合蛋白α(c/ebpα)、ccaat增强子结合蛋白β(c/ebpβ)，及固醇调节元件结合蛋白异形体1(srebp1)、脂蛋白脂酶(lpl)等。因此，明确山羊脂肪细胞分化的分子机制意义重大。
4、klfs是一类在真核生物体内广泛分布的锌指蛋白，其功能复杂多样。目前共发现klfs家族成员有18个，成员间存在直接或间接相互作用，在不同的生物过程中都发挥重要调控功能。已有研究证明klfs家族有多个成员参与脂肪分化，并发挥重要的作用。klf6是klfs家族中的重要一员，最早从小鼠和人的肝脏星形间叶细胞和胎盘中获得，klf6具有典型的锌指(c2h2)结构域，其锌指结构域由3个锌指残基构成。klf6作为转录因子，可能通过结合基因的启动子来调控靶基因的表达。近年在小鼠上的研究表明：(1)klf6参与到前体脂肪细胞分化及脂质代谢过程中；(2)在3t3-l1细胞的研究中klf6可能通过抑制dlk1来促进脂肪细胞分化；(3)klf6增加了pparγ的活性，而敲除klf6基因则pparγ活性受到抑制(其中pparγ是参与脂肪细胞分化过程的重要的核受体类转录因子)。
5、有研究经生物信息学分析发现：山羊klf6蛋白潜在的磷酸化位点共53个，其中酪氨酸(tyr)、丝氨酸(ser)及苏氨酸(thr)磷酸化位点的个数分别为5、37及11，有20个o-糖基化位点，分别为8个苏氨酸糖(thr)基化位点和12个丝氨酸(ser)糖基化位点，存在1个n-糖基化位点；同时分析发现山羊klf6蛋白无信号肽及跨膜结构域，其主要功能位于细胞核(95.7％)，其次是液泡(4.3％)，二级结构预测结果显示其可能由总氨基酸的19.18％(61个氨基酸)形成α-螺旋、12.26％(39个氨基酸)形成延伸链及68.55％(218个氨基酸)形成无规则卷曲。该研究还根据klf6基因在分化前后的山羊皮下脂肪细胞分化中的表达水平及结合在3t3-l1中的研究结果，推测klf6基因促进山羊皮下脂肪细胞分化(王江林,王永,孟庆勇等.山羊klf6的分子克隆及其时空表达特征分析.华北农学报,2021,36(02):226-232.)。另外有研究表明klf6基因在牦牛肺脏中高表达(朱江江,林亚秋,左璐璐等.牦牛klf5、klf6、klf7基因的克隆表达及其与肌内脂肪含量的相关性分析[j].畜牧兽医学报,2017,48(03):416-424.)，该研究同时指出klf6基因的表达与imf含量无相关性。
技术实现思路
1、本专利技术目的在于提供一种调控山羊前体脂肪细胞分化的靶标基因klf6的应用。
2、为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：
3、确定klf6基因为一个调控山羊前体脂肪细胞分化的靶标基因的方法，包括以下步骤：
4、以山羊klf6基因为目的基因，在山羊前体脂肪细胞中分别对目的基因进行过表达及rna干扰。
5、优选的，所述方法具体包括以下步骤：将山羊肌内前体脂肪细胞或山羊皮下前体脂肪细胞经细胞培养后作为宿主细胞，分别将山羊klf6基因过表达载体、山羊klf6基因干扰载体转染宿主细胞及进行诱导分化，然后利用实时荧光定量pcr(qpcr)检测klf6基因和分化标志基因与脂滴积聚标志基因的表达情况，并利用油红o染色和bodipy染色在形态学上观察脂肪细胞分化及半定量脂滴表达情况，同时利用试剂盒测定脂肪细胞甘油三酯(tg)含量。
6、优选的，所述细胞培养具体包括以下步骤：
7、(1)复苏
8、将冻存的山羊肌内前体脂肪细胞或山羊皮下前体脂肪细胞接种于含有双抗及胎牛血清的deme/f12培养基中，然后在37℃培养24-48h；
9、(2)传代
10、待细胞生长至80％-90％时用胰酶消化细胞，然后转接至新鲜培养基(例如，含10％胎牛血清的deme/f12培养基)中继续进行培养；
11、(3)铺板
12、采用某次传代后的细胞，且待细胞生长至80％-90％时将细胞接种至细胞孔板(例如6、12或24孔板)中，待孔内细胞生长至80％-90％时即可用于转染。
13、优选的，所述转染宿主细胞及进行诱导分化具体包括以下步骤：将山羊klf6基因过表达载体和山羊klf6基因干扰载体以及相应的对照载体分别采用转染试剂配制预混液，混匀后于22-25℃孵育15-20min；使用孵育后的预混液并于37℃处理孔内细胞16-24h，然后使用油酸继续处理孔内细胞48-60h。<本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.确定KLF6基因为调控山羊前体脂肪细胞分化的靶标基因的方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述确定KLF6基因为调控山羊前体脂肪细胞分化的靶标基因的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：将山羊肌内前体脂肪细胞或山羊皮下前体脂肪细胞经细胞培养后作为宿主细胞，分别将山羊KLF6基因过表达载体、山羊KLF6基因干扰载体转染宿主细胞及进行诱导分化，然后检测KLF6基因和分化标志基因与脂滴积聚标志基因的表达情况，并在形态学上观察细胞分化及脂滴表达情况，同时测定细胞甘油三酯含量。
3.根据权利要求2所述确定KLF6基因为调控山羊前体脂肪细胞分化的靶标基因的方法，其特征在于：所述细胞培养具体包括以下步骤：
4.根据权利要求2所述确定KLF6基因为调控山羊前体脂肪细胞分化的靶标基因的方法，其特征在于：所述转染宿主细胞及进行诱导分化具体包括以下步骤：将山羊KLF6基因过表达载体和山羊KLF6基因干扰载体以及相应的对照载体分别采用转染试剂配制预混液后于22-25℃孵育15-20min；使用孵育后的预混液并于37℃处理孔内细胞16-24h，然后使用
5.根据权利要求2所述确定KLF6基因为调控山羊前体脂肪细胞分化的靶标基因的方法，其特征在于：所述山羊肌内前体脂肪细胞经山羊KLF6基因干扰载体或山羊KLF6基因过表达载体转染及进行诱导分化后，检测以下脂滴积聚标志基因中的一种或多种：DGAT1、DGAT2、ADFP、TIP47、AGPAT6、GPAM、HSL、ATGL；所述山羊肌内前体脂肪细胞经山羊KLF6基因干扰载体或山羊KLF6基因过表达载体转染及进行诱导分化后，检测以下分化标志基因中的一种或多种：AP2、CEBPα、PPARγ、DLK1、SREBP1、LPL、CEBPβ、FASN、GLUT4、ACC 。
6.根据权利要求2所述确定KLF6基因为调控山羊前体脂肪细胞分化的靶标基因的方法，其特征在于：所述山羊皮下前体脂肪细胞经山羊KLF6基因干扰载体或山羊KLF6基因过表达载体转染及进行诱导分化后，检测以下脂滴积聚标志基因中的一种或多种：DGAT1、DGAT2、ADFP、TIP47、AGPAT6、GPAM、HSL、ATGL；所述山羊皮下前体脂肪细胞经山羊KLF6基因干扰载体或山羊KLF6基因过表达载体转染及进行诱导分化后，检测以下分化标志基因中的一种或多种：AP2、CEBPα、PPARγ、DLK1、SREBP1、LPL、CEBPβ、FASN、ACC。
7.山羊KLF6基因实时荧光定量PCR试剂在检测用于调控山羊前体脂肪细胞分化的靶标基因中的应用。
8.山羊KLF6基因过表达载体和/或山羊KLF6基因干扰载体在调控山羊前体脂肪细胞分化中的应用，其特征在于：所述前体脂肪细胞经山羊KLF6基因干扰载体转染后在诱导分化中表现为分化及脂滴积聚受到抑制。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述前体脂肪细胞为山羊肌内前体脂肪细胞或山羊皮下前体脂肪细胞。
10.山羊KLF6基因过表达载体和/或山羊KLF6基因干扰载体在改善山羊羊肉品质中的应用。
...【技术特征摘要】
1.确定klf6基因为调控山羊前体脂肪细胞分化的靶标基因的方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述确定klf6基因为调控山羊前体脂肪细胞分化的靶标基因的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：将山羊肌内前体脂肪细胞或山羊皮下前体脂肪细胞经细胞培养后作为宿主细胞，分别将山羊klf6基因过表达载体、山羊klf6基因干扰载体转染宿主细胞及进行诱导分化，然后检测klf6基因和分化标志基因与脂滴积聚标志基因的表达情况，并在形态学上观察细胞分化及脂滴表达情况，同时测定细胞甘油三酯含量。
3.根据权利要求2所述确定klf6基因为调控山羊前体脂肪细胞分化的靶标基因的方法，其特征在于：所述细胞培养具体包括以下步骤：
4.根据权利要求2所述确定klf6基因为调控山羊前体脂肪细胞分化的靶标基因的方法，其特征在于：所述转染宿主细胞及进行诱导分化具体包括以下步骤：将山羊klf6基因过表达载体和山羊klf6基因干扰载体以及相应的对照载体分别采用转染试剂配制预混液后于22-25℃孵育15-20min；使用孵育后的预混液并于37℃处理孔内细胞16-24h，然后使用油酸于37℃处理孔内细胞48-60h。
5.根据权利要求2所述确定klf6基因为调控山羊前体脂肪细胞分化的靶标基因的方法，其特征在于：所述山羊肌内前体脂肪细胞经山羊klf6基因干扰载体或山羊klf6基因过表达载体转染及进行诱导分化后，检测以下脂滴积聚标志基因中的一种或多种：dgat1、dgat2、adfp、tip47、agpat6、gpam、hsl、at...
【专利技术属性】
技术研发人员：林亚秋，熊燕，曲比伍且，王江林，王永，李志雄，史海涛，李艳艳，陈娟，王友利，朱江江，刘伟，
申请(专利权)人：西南民族大学，
类型：发明
国别省市：
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