【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化学领域，涉及生物材料尤其是核酸材料与单细胞材料的多组学分析。
技术介绍
1、高通量测序技术的出现，已经在单细胞基因组学和转录组学领域引发了一次革命式的转变，基于单细胞的转录组测序可以揭示前所未有的细胞多样性。虽然rna提供了关于细胞功能的重要见解，但是蛋白质才是细胞的主要功能分子。因此，对蛋白质组的无偏量化对于补充单细胞转录组学具有重要潜力，可以提供对不同细胞状态更全面的描述和表征。
2、尽管单细胞rna测序取得了快速进展，但高通量蛋白质定量技术仍然滞后。这可能归因于蛋白质的低丰度以及单细胞内蛋白质修饰和动态性的高多样性。值得注意的是，与核酸不同，蛋白质无法被扩增放大。目前，各种基于抗体的技术，如流式细胞术和质谱流式细胞术，已用于检测单个细胞中的蛋白质。但这两种方法都受到荧光标记的光谱重叠限制(～17)，或者流式细胞术或质谱细胞术中稳定同位素的数量限制(～40)。另一方面，已经发展出抗体寡核苷酸技术来定量单个细胞的细胞表面蛋白质，诸如cite-seq、reap-seq和ab-seq利用带有dna条形码的抗体，与现有的单细胞rna测序平台相结合，通过高通量测序在单细胞分辨率上同时进行表位和mrna的分析。此外，dna-抗体偶联物的制备妨碍了条形码抗体文库的可扩展和集成构建。此外，这些技术的高昂成本也限制了它们在科学研究中的应用。因此，迫切需要在单细胞分辨率下实现高通量蛋白质定量分析的低成本分子工具。
3、核酸适体，常被称为“化学抗体”，是新型的分子识别探针，可形成独特的三维构象，并对蛋白
4、本专利技术我们对核酸适体序列进行了改造，利用高通测序测定与细胞结合的核酸适体数量和种类，从而使其在多细胞水平和单细胞水平实现细胞膜表面不同蛋白分子的检测。我们观察到测序数据与流式数据的阳性率结果之间的显著正相关性。这项技术与商业化的10xgenomics单细胞rna测序平台兼容，并在同一样本中实现了mrna和蛋白质检测，即使mrna水平过低也能测量蛋白质丰度。此外，这种方法还能更深入地理解治疗干预的潜在机制。因此，通过利用高通量测序检测细胞结合的核酸适体来分析细胞膜分子的巨大潜力，him-seq成为了通过同时集成mrna和蛋白质来表征细胞异质性和表型的创新工具。
技术实现思路
1、细胞膜蛋白参与调控细胞运动、物质运输、信号转导等重要生命过程，被广泛用作疾病精准诊断和药物靶向治疗领域。对转录组和蛋白组进行单细胞分辨率的同时检测，可以加深我们在单细胞水平基因层面和表型层面的理解和认识。目前，单细胞膜蛋白组学的测定主要依赖于抗体与寡核苷酸的偶联，结合高通量测序技术将蛋白质组的信息转化为可读取的核酸信息。然而，目前抗体-寡核苷酸偶联物的化学制备面临多项挑战，例如成本高、偶联效率低、偶联比例难控制等。此外，抗体较大的分子量引起的空间位阻可能会影响结果的准确判定。核酸适体是与抗体一样具有高亲和、高特异性结合靶标的识别探针，本文发展了一种基于核酸适体高通量测序的表征细胞膜蛋白的方法，即himseq。
2、本专利技术首先提供用于多组学分析的核酸适体库，所述库中核酸适体3’端和/或5’端连接捕获序列和通用引物。
3、在本专利技术的具体实施方式中，所述捕获序列不为poly(a)；优选地，所述捕获序列与分子标签微珠或磁珠的相应片段互补以实现核酸适体的捕获。
4、在本专利技术的具体实施方式中，所述通用引物通过反转录或连接反应在核酸适体中引入umi标签。
5、在本专利技术的具体实施方式中，所述核酸适体的结构为：通用引物-核酸适体序列-捕获序列(5’到3’)。
6、在本专利技术的具体实施方式中，所述核酸适体被荧光标记。
7、在本专利技术的具体实施方式中，所述核酸适体靶点已知。
8、在本专利技术的具体实施方式中，所述核酸适体库中的核酸适体是通过cell-selex方法获得。
9、在本专利技术的具体实施方式中，所述核酸适体通过高级别浆液性卵巢癌细胞系ovcar4作为靶细胞，低级别浆液性卵巢癌细胞系a2780作为阴性细胞，进行筛选获得。
10、在本专利技术的具体实施方式中，所述筛选为16轮。
11、在本专利技术的具体实施方式中，通过筛选获得包含5000个核酸适体的库。
12、在本专利技术的具体实施方式中，所述核酸适体的靶点包括：pd-l1(cd274)、cd71、cd318、ptprf、ptk-7、sell、tfrc、cd274、met、itga3、epcam、cd109、areg、pnrp、l1cam、egfr、cd24、tfip11、cdcp1。
13、在本专利技术的具体实施方式中，所述核酸适体的序列为：
14、
15、本专利技术第二方面提供对生物样品进行多组学分析的方法，所述方法包括：
16、1)生物样品与本专利技术第一方面的核酸适体库接触；
17、2)与生物样品结合的核酸适体连接umi；
18、3)对生物样品进行转录组和核酸适体库的高通量测序；
19、4)对测序数据进行分析。
20、在本专利技术的具体实施例方式中，所述生物样品为来自临床样本或细胞系的单细胞悬浮液。
21、在本专利技术的具体实施例方式中，细胞与核酸适体孵育后，通过流式细胞仪进行分选。
22、在本专利技术的具体实施例方式中，所述高通量测序基于10x平台进行。
23、在本专利技术的具体实施例方式中，步骤2)中使用包含双抓手序列的珠子，其中一个抓手序列聚(dt)捕获mrna，另一抓手序列通过与上述捕获序列配对捕获和引导核酸适体。
24、在本专利技术的具体实施例方式中，所述测序数据中核酸适体库的测序结果代表细胞表面蛋白/膜蛋白的表达水平。
25、本专利技术第三方面提供第一方面核酸适体库或第二方面方法的应用，包括：
26、1)用于细胞聚类或分型；
27、2)用于细胞因子分析；
28本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于多组学分析的核酸适体库，所述库中核酸适体3’端和/或5’端连接捕获序列和通用引物；
2.如权利要求1所述的核酸适体库，所述核酸适体的结构为：通用引物-核酸适体序列-捕获序列(5’到3’)。
3.如权利要求1所述的核酸适体库，所述核酸适体库中的核酸适体通过Cell-SELEX方法获得；
4.如权利要求1所述的核酸适体库，所述库中核酸适体的靶点已知，
5.对生物样品进行多组学分析的方法，所述方法包括：
6.如权利要求5所述的对生物样品进行多组学分析的方法，其中步骤1)还包括根据结合核酸适体的荧光信号进行分选，同时进行多组学测序分选。
7.如权利要求5所述的对生物样品进行多组学分析的方法，所述生物样品为来自临床样本或细胞系的多细胞体系或单细胞悬浮液。
8.权利要求1-4任一项所述的核酸适体库或权利要求5所述的方法的用途，包括：
9.用于多组学分析核酸适体构建体库，所述核酸适体构建体的结构为3’端和/或5’端连接有捕获序列和UMI的核酸适体；
10.一种多组学分析的试剂盒或
...【技术特征摘要】
1.用于多组学分析的核酸适体库，所述库中核酸适体3’端和/或5’端连接捕获序列和通用引物；
2.如权利要求1所述的核酸适体库，所述核酸适体的结构为：通用引物-核酸适体序列-捕获序列(5’到3’)。
3.如权利要求1所述的核酸适体库，所述核酸适体库中的核酸适体通过cell-selex方法获得；
4.如权利要求1所述的核酸适体库，所述库中核酸适体的靶点已知，
5.对生物样品进行多组学分析的方法，所述方法包括：
6.如权利要求5所述的对生物样品进行多组学分析的方法，其中...
【专利技术属性】
技术研发人员：谭蔚泓，邴涛，武晓秋，刘雨晴，宋佳，符婷，吴芩，
申请(专利权)人：中国科学院基础医学与肿瘤研究所筹，
类型：发明
国别省市：
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