【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体地涉及全人源单域抗体噬菌体展示抗体文库及其构建方法。
技术介绍
1、抗体文库是获得高特异性、高亲和力的有效手段。目前，抗体文库主要有驼源库和兔源库，其中驼源库为单域抗体文库，兔源库为scfv库。
2、除了利用噬菌体展示库获得人源抗体外，新兴的人源抗体基因转基因鼠免疫亦是两种获得人源抗体的方法之一。这种转基因鼠的构建需要多轮转基因和多轮杂交、筛选以使之纯合，耗时多年。而且因为转基因技术的限制，获得全部人源抗体基因转化小鼠的难度极大，有些转基因鼠丢失了部分人源抗体基因，因而抗体基因的多样性受损。从转基因鼠获得单克隆抗体需要经过杂交瘤大量、多轮的筛选，获得的单克隆必须经过较为复杂的克隆才能进行测序。与转基因鼠获得人源抗体相比，噬菌体展示获得人源抗体从建库、淘选到测序，耗时短，操作简单。通常，从建库开始，3个月即可获得单克隆抗体序列。
3、随着新的抗体基因的发现，数据库中的抗体基因序列数据在逐年累积，早年所构建的抗体文库存在着抗体基因不全、多样性不足等缺陷。因抗体文库已建成，无法通过仅补充新抗体基因的方式将该部分抗体基因添加到已建库中，这些新的抗体基因只能存在于新建的抗体文库中。
4、抗体文库的多样性是其质量的重要指标。多样性指抗体文库含有的不同序列的抗体基因或抗体蛋白的多少以及序列差异的大小。多样性越大，抗体种类越多，从而越容易获得性能好的抗体；若多样性差，甚至无法获得有用抗体。
5、然而，目前尚缺乏高质量的高多样性的人源单域抗体文库。因此本领域迫切需要开发高质量
技术实现思路
1、本专利技术的目的就是提供一种高质量的高多样性的人源单域抗体及其构建方法和应用。
2、在本专利技术第一方面，提供了一种全人源单域抗体噬菌体展示抗体文库的构建方法，包括以下步骤：
3、(a)提取人pbmc的总rna；
4、(b)以所述总rna为模板，通过反转录，合成cdna；
5、(c)以所述cdna为模板，用第一引物集进行第一轮pcr扩增，从而获得第一轮扩增产物；其中，第一引物集包括seq id no:1～43所示的正向引物和seq id no: 44-47所示的反向引物；
6、(d)以第一轮扩增产物为模板，用第二引物集进行第二轮pcr扩增，从而获得第二轮扩增产物；其中，第二引物集包括seq id no:48～90所示的正向引物和seq id no:91-94所示的反向引物；
7、(e)将用于构建文库的载体和所述第二轮扩增产物用限制性内切酶i进行酶切，获得经酶切的线性化的载体片段和线性化的抗体基因片段；
8、(f)将所述经酶切的线性化的载体片段和线性化的抗体基因片段进行连接反应，从而获得连接产物；和
9、(g)将所述连接产物导入用于噬菌体展示的宿主细胞，从而获得所述的全人源单域抗体噬菌体展示抗体文库。
10、在另一优选例中，所述的用于噬菌体展示的宿主细胞包括大肠杆菌。
11、在另一优选例中，所述步骤(a)包括：
12、(a1)人pbmc的分离
13、采集抗凝血，分离获得pbmc；
14、(a2)总rna的提取
15、取所述pbmc，提取总rna。
16、在另一优选例中，所述步骤(b)包括：cdna的合成，即，以步骤(a2)提取的pbmc 总rna为模板，反转录合成cdna；
17、在另一优选例中，步骤(c)中还包括：对第一轮pcr扩增产物进行核酸电泳检测。
18、在另一优选例中，步骤(d)中还包括：对第二轮pcr扩增产物进行核酸电泳检测。
19、在另一优选例中，所述的用于构建文库的载体包括：pcomb3。
20、在另一优选例中，步骤(g)中还包括测定多样性：取阳性克隆，进行噬菌粒测序并分析序列多样性。
21、在另一优选例中，步骤(c)所述的第一轮pcr扩增，其反应体系为：ddh2o 13.6μl，2.5mm dntps 1.6μl，10×buffer 2μl，cdna 0.8μl，10μm上游引物 1μl，10μm下游引物1μl，ex taq 0.08μl，总体积20μl；
22、在另一优选例中，步骤(c)所述的第一轮pcr扩增，其反应程序为：94℃4min， 98℃10s，59℃40s，72℃50s，72℃10min，扩增循环25次。
23、在另一优选例中，步骤(d)所述的第二轮pcr扩增，其反应体系为：10×buffer 2.5μl，2.5mm dntps 1.6μl，第一轮扩增回收产物15ng，10μm上游引物1μl， 10μm下游引物1μl，ex taq 0.1μl，ddh2o补足至总体积25μl。
24、在另一优选例中，步骤(d)所述的抗体基因第二轮pcr扩增，其反应程序为： 94℃4min，98℃10s，59℃40s，72℃50s，72℃10min，扩增循环15次。
25、本专利技术的第二方面，提供了一种全人源单域抗体噬菌体展示抗体文库，所述全人源单域抗体噬菌体展示抗体文库是用如权利要求1～5中任一项所述的构建方法构建的。
26、在另一优选例中，所述文库的阳性率为≥80％，较佳地，≥93％。
27、在另一优选例中，所述文库的抗体序列多样性为≥80％，较佳地，≥95％。
28、在另一优选例中，所述文库的库容为≥1×108pfu，较佳地，≥1×109pfu。
29、本专利技术的第三方面，提供了一种用于构建全人源单域抗体噬菌体展示抗体文库的引物集，所述的引物集包括：序列如seq id no:1～94所示的引物。
30、应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
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1.一种全人源单域抗体噬菌体展示抗体文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(b)包括：cDNA的合成，即，以步骤(a2)提取的PBMC总RNA为模板，反转录合成cDNA。
3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(c)中还包括：对第一轮PCR扩增产物进行核酸电泳检测。
4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(d)中还包括：对第二轮PCR扩增产物进行核酸电泳检测。
5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(g)中还包括测定多样性：取阳性克隆，进行噬菌粒测序并分析序列多样性。
6.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(c)所述的第一轮PCR扩增，其反应体系为：ddH2O 13.6μL，2.5mM dNTPs 1.6μL，10×buffer 2μL，cDNA0.8μL，10μM上游引物1μL，10μM下游引物1μL，Ex Taq 0.08μL，总体积20μL。
7.一种全人源单域抗体噬菌体展示抗体文库，其特征在于，所述全人源
8.如权利要求7所述的文库，其特征在于，所述文库的阳性率为≥80％，较佳地，≥93％。
9.如权利要求7所述的文库，其特征在于，所述文库的库容为≥1×108pfu，较佳地，≥1×109pfu。
10.一种用于构建全人源单域抗体噬菌体展示抗体文库的引物集，其特征在于，所述的引物集包括：序列如SEQ ID No:1～94所示的引物。
...【技术特征摘要】
1.一种全人源单域抗体噬菌体展示抗体文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(b)包括：cdna的合成，即，以步骤(a2)提取的pbmc总rna为模板，反转录合成cdna。
3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(c)中还包括：对第一轮pcr扩增产物进行核酸电泳检测。
4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(d)中还包括：对第二轮pcr扩增产物进行核酸电泳检测。
5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(g)中还包括测定多样性：取阳性克隆，进行噬菌粒测序并分析序列多样性。
6.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(c)所述的第一轮pcr扩增，其反应体系为：ddh...
【专利技术属性】
技术研发人员：张军锋，郭志刚，
申请(专利权)人：浙江蓝盾药业有限公司，
类型：发明
国别省市：
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