人CD70抗原结合多肽制造技术

本发明专利技术公开了一种人CD70抗原结合多肽，其是以人源CD70为靶点，开发的特异性好，亲合力较高的抗原结合多肽。相对于现有技术，本发明专利技术成功制备了人CD70抗原结合多肽(融合蛋白)，该多肽特异性好，亲合力较高，并可结合细胞表面表达的人源CD70，该抗人CD70单克隆抗原结合多肽是肿瘤免疫治疗的潜在药物。

Human CD70 antigen binding peptide

【技术实现步骤摘要】
人CD70抗原结合多肽
本专利技术涉及人CD70抗原结合多肽，属于抗原结合多肽

技术介绍
CD70分子，即肿瘤坏死因子受体超家族7因子(TNFSF7)。多肽链长193个a.a.，分子量21.1KD，是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白(尚未见可溶形式)，C端155个氨基酸位于膜外。胞外的第一、三及第二、四个半胱氨酸之间形成二硫键，维持胞外部分的空间结构。通常其以同源三聚体形式存在于膜上。在正常组织中，CD70的细胞表达谱较窄，主要表达于生发中心的B细胞(诱导分泌抗体)和局部淋巴组织的T细胞，在胸腺髓质上皮细胞中低水平表达。但其表达可被抗原诱导大量增加并随着免疫应答的减弱而减少，比如抗原诱导活化的T、B细胞中高表达CD70。同时其表达受到细胞因子的调控，如IL1a、IL12、TNFa、GM-CSF可上调CD70表达，IL4、IL10下调CD70表达。另外在成熟的DCs中，在TLR信号通路的介导下CD70表达。这些现象正好表明CD70为初始T细胞完全活化所需的一种协同刺激分子，在调控免疫应答中发挥重要作用。其与配体CD27相互作用，不仅起着T细胞活化第二信号的作用，而且二者之间的互作还可以调节B、NK等免疫细胞的增殖和分化。短暂表达于活化的T和B淋巴细胞及成熟DC细胞中的CD70，在病理状态下却高表达于多种肿瘤组织中。大量研究表明，CD70在淋巴瘤、肾癌、胶质细胞瘤、乳腺癌、血源性恶性肿瘤(如霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病等)等多种肿瘤组织中高水平表达。同时观察到CD27在这些组织中的表达与CD70同步上升或下降。可能二者作为配体/受体对，形成了反馈环，促进淋巴细胞的增殖与分化，反而起到介导疾病发生的作用。CD70与CD27互作后，CD27活化，TRAF2/5结合到其胞内段，进一步激活NF-KB和c-Jun激酶信号通路，引起细胞增殖、生存和分化等。另外，亦有人认为CD70与CD27结合后也可能使CD27胞内段结合Siva从而引起Caspase介导的细胞凋亡。鉴于以上现象，以CD70为靶点制备特异性抗体，开展肿瘤免疫治疗引起人们浓厚兴趣。目前针对CD70靶点，CART治疗、抗体药和抗体偶联药物三种应用方式均在开发中，进展最快的为强生与arGEN-X合作开发的库萨图珠单抗(Cusatuzumab)，目前已完成I期临床，结果显示库萨图珠单抗联合维达扎可显著降低AML患者骨髓中的白血病干细胞，证实该靶点的可靠性。鉴于CD70/CD27分子对重要免疫调节功能，对CD70进行调控必然会引起一系列的T细胞、甚至B细胞及NK细胞等淋巴细胞的信号传递及生理反应，是一个很理想的免疫治疗靶点，合理应用有可能调动多种细胞免疫。同时以此为靶点，药物开发方向较多(CART治疗、抗体药和抗体偶联药物，甚至多特异性抗体等。)。目前进行临床实验中的抗体类有Cusatuzumab、Vorsetuzumab及抗体偶联药物中的抗体部分均为进行了人源化的抗体，具有可变区、恒定区等抗体结构，可变区仍可细分为框架区和高变区，可见其仍然为传统的抗体，而非多肽。传统的抗体药，在开发过程中必须有抗体人源化环节，以通过抗体工程降低其在人体内的免疫源性。就目前的技术发展水平，抗体人源化仍然是一项有挑战工作，技术障碍不小，该工程风险高、费时、费力、费钱。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术存在的问题，本专利技术公开了一种人CD70抗原结合多肽。技术方案：为了达到上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种人CD70抗原结合肽，所述多肽为单链结构，并且包括氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的抗原结合部位。作为本专利技术的一种实施方案，所述人CD70抗原结合肽包括信号肽和抗原结合部位，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。或者，所述人CD70抗原结合肽包括信号肽、抗原结合部位和人源Fc区域，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。或者，所述人CD70抗原结合肽包括信号肽、抗原结合部位、柔性连接肽和人源Fc区域，其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。所述的人CD70抗原结合肽的制备方法，是采用噬菌体展示肽库筛选的方法。具体的方法如下：以商品化的重组人CD70His标签蛋白和噬菌体展示12肽库为起始材料。将CD70His标签蛋白包被在免疫管上，用12肽库与其孵育，洗去未结合/结合弱的噬菌体，将与CD70His标签蛋白结合的噬菌体洗脱下来。如此反复若干次，每次改变CD70His标签蛋白包被量和洗涤条件，逐次淘汰掉结合弱的噬菌体并尽可能保留更多的结合强的噬菌体。利用空斑形成实验，将获得的结合能力强的噬菌体单克隆化，利用单克隆培养上清进行ELISA筛选，并对单克隆进行核酸序列测定。建立编码序列(本专利技术一种实施方案，将分泌型荧光素酶的信号肽、十二肽即抗原结合部位、人源IgG2Fc和His标签的编码序列连接)，同框阅读，构建哺乳动物表达载体。转染CHO-K1细胞，取上清进行流式细胞术检测。大量转染流式测定阳性的表达载体，利用Ni-NTA亲和层析柱从上清中纯化获得融合蛋白，并对其与CD70结合特性进行鉴定。一种核酸分子，其含有编码所述的人CD70抗原结合肽的序列。一种载体，其含有所述的核酸分子。一种宿主细胞，其含有所述的核酸分子或所述的载体。一种试剂盒，其包括所述的人CD70抗原结合肽。所述的人CD70抗原结合多肽在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测CD70在样品中的存在或其水平。所述的人CD70抗原结合肽在制备抗癌或癌症检测或药物中的应用。本专利技术以CD70为靶点，开发抗原结合多肽。抗原结合多肽与抗体一样，均为蛋白类物质，均具有抗原结合功能。因此，抗原结合多肽具有抗体相同的功能及药物开发方向。但其与抗体不同，是一类全新的靶点结合物，目前尚未有靶向CD70的抗原结合多肽研发的报道。本专利技术中的多肽为12肽，相比于抗体具有免疫原性极小、不存在免疫性的问题，避免了抗体人源化环节，并且易于穿过血管、可能的给药方式多样(口服、肌肉注射、血液注射)、易于保存运输等优点。同时本专利技术实施过程中采取了噬菌体展示肽库筛选的方法，将噬菌体展示肽库运用于CD70靶向物的开发，亦是本专利技术的创新。技术效果：相对于现有技术，本专利技术成功制备了人源CD70抗原结合多肽(融合蛋白)，该多肽特异性好，亲合力较高，并可结合细胞表面表达的人源CD70，该抗人CD70单克隆抗原结合多肽是肿瘤免疫治疗的潜在药物。附图说明：图1：phage粗培液与人源CD70结合ELISA检测结果。在噬菌体淘选过程中，用含有phage病毒颗粒的LB培养基50ul和5ul两种加样量做重复验证。图2：人源CD70抗原结合多肽融合蛋白过表达CHO-K1细胞系转染中使用的载体结构示意图，MCS为多克隆位点，靶基因插入此位置。图3：CHO-K1超表达人源CD70抗原结合多肽融合蛋白SDS-PAGE检测。图中左、右侧泳道分别为为未转染和转染后的CHO-K1细胞，加框处为表达的融合蛋白。图4：人本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人CD70抗原结合肽，其特征在于，所述多肽为单链结构，并且包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的抗原结合部位。/n

【技术特征摘要】
1.一种人CD70抗原结合肽，其特征在于，所述多肽为单链结构，并且包括氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的抗原结合部位。


2.根据权利要求1所述的人CD70抗原结合肽，其特征在于，所述人CD70抗原结合肽包括信号肽和抗原结合部位，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.根据权利要求1所述的人CD70抗原结合肽，其特征在于，所述人CD70抗原结合肽包括信号肽、抗原结合部位和人源Fc区域，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。


4.根据权利要求1所述的人CD70抗原结合肽，其特征在于，所述人CD70抗原结合肽包括信号肽、抗原结合部位、柔性连接肽和人源Fc区域，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张军锋，郭志刚，
申请(专利权)人：浙江蓝盾药业有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33