杂交瘤细胞株6F9、抗体及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体公开了一种杂交瘤细胞株6F9、其产生的抗人CD70单克隆抗体及其应用，本发明专利技术是以具有生物活性的人CD70重组蛋白为抗原，通过杂交瘤技术筛选制备得到在细胞水平能高亲和力结合人CD70特异性单克隆抗体，该抗体在肿瘤免疫治疗中具有潜在的价值。

Hybridoma cell line 6f9, antibody and its application

【技术实现步骤摘要】
杂交瘤细胞株6F9、抗体及其应用
本专利技术属于生物基因工程抗体技术，特别是涉及一种杂交瘤细胞株6F9、其产生的抗人CD70单克隆抗体及其应用。技术背景CD70是Ⅱ型跨膜糖蛋白，也属TNF家族。人CD70是一个由193个氨基酸组成的三聚体，其中胞膜外的155个氨基酸序列与TNF配体超家族的其他成员具有一定的同源性。细胞因子受体CD27是肿瘤坏死因子受体(TFNR)超家族的成员，其在细胞生长和分化以及凋亡中起作用。CD27的配体是CD70，属于配体的肿瘤坏死因子家族。正常情况下，CD70只瞬时表达在激活的T和B淋巴细胞及成熟的DC细胞表面，在其他非淋巴正常组织或细胞上一般不表达。然而，在许多血液瘤和实体瘤中，CD70组成型表达在肿瘤细胞表面，包括肾细胞癌、转移性乳腺癌、脑肿瘤、白血病、淋巴瘤和鼻咽癌等。CD27主要表达在成熟T淋巴细胞、记忆B淋巴细胞、生发中心B细胞及NK细胞上，在一些血液肿瘤细胞上也表达CD27。CD70与CD27相互作用后，使得CD27胞内段结合TRAF2/5，从而激活NF-KB和c-Jun激酶信号通路，引起细胞增殖、生存和分化等。另外，CD70与CD27结合后也可能使CD27胞内段结合Siva从而引起Caspase介导的细胞凋亡。肿瘤细胞表面组成型表达的CD70主要通过四种可能的机制促进肿瘤的免疫逃逸。1.增加免疫抑制性调节T细胞数量；2.诱导T细胞凋亡；3.诱导T细胞耗竭；4.促进共表达CD27的肿瘤细胞增殖、生存。基于上述特性，CD70作为抗肿瘤治疗靶点，其主要具有以下三方面优势：1.较为广泛的适应症；2.特异性较强，毒性作用较小，适合CART选择靶点；3.CD70抗体可以介导内吞从而成为ADC优秀靶点。目前尚未有针对CD70抗体药上市，基本上都处于不同临床时期，而且以ADC为主。
技术实现思路
专利技术目的：针对上述现有技术，本专利技术提供了一种杂交瘤细胞株6F9、其产生的抗人CD70单克隆抗体，还提供了所述抗人CD70单克隆抗体的制备方法，以及抗人CD70单克隆抗体的可变区氨基酸序列及核酸序列。本专利技术还进一步提供了上述单克隆抗体的制药应用。技术方案：本专利技术所述的杂交瘤细胞株6F9，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO:C2019259，地址：武汉市武汉大学，保藏时间：2019年10月29日。本专利技术所述杂交瘤细胞株6F9产生的抗人CD70单克隆抗体。所述抗人CD70单克隆抗体，其重链可变区的CDRH1为SEQIDNO：4所示氨基酸序列，CDRH2为SEQIDNO：6所示氨基酸序列，CDRH3为SEQIDNO：8所示氨基酸序列；其轻链可变区的CDRL1为SEQIDNO：12所示氨基酸序列，CDRL2为SEQIDNO：14所示氨基酸序列，CDRL3为SEQIDNO：16所示氨基酸序列。进一步的，所述抗人CD70单克隆抗体重链可变区为SEQIDNO：2所示的氨基酸序列，其轻链可变区为SEQIDNO：10所示的氨基酸序列。所述抗人CD70单克隆抗体还包括选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM或IgA亚型的重链恒定区，以及选自Kappa或者Lambda亚型的轻链恒定区。优选的，所述抗人CD70单克隆抗体还包括选自IgG1亚型的重链恒定区，以及选自Kappa亚型的轻链恒定区。本专利技术还公开了一种编码上述抗人CD70单克隆抗体的核酸，其重链可变区如SEQIDNO：1所示，其轻链可变区如SEQIDNO：9所示。进一步的，包含上述抗人CD70单克隆抗体的药物组合物、检测试剂或者试剂盒也在本专利技术的保护范围内。上述单克隆抗体在制备治疗与CD70表达异常或过量、失控相关疾病的药物中的应用也在本专利技术的保护范围内。所述疾病包括肿瘤、癌症等。本专利技术以商品化的具有生物活性的重组人CD70-mFc融合蛋白作为免疫原，免疫Balb/c小鼠，待其血清效价达到融合要求，取其脾细胞与SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞进行细胞融合，通过HAT选择性培养基筛选得到能稳定分泌抗人CD70单克隆抗体的杂交瘤细胞株6F9，经亚克隆化及扩大培养后，在分子水平上进行抗体重、轻链可变区基因的调取测序。单克隆抗体可通过将杂交瘤细胞注射至小鼠腹腔，取腹水收集后经硫酸铵沉淀法和ProteinG亲和层析柱纯化获得，并对其抗体特性进行鉴定及体外生物活性验证。有益效果：本专利技术成功制备了杂交瘤细胞株6F9，并通过其产生了抗人CD70单克隆抗体，该抗体特异性好，亲合力高，在细胞水平上可以高亲和力结合人和食蟹猴CD70，该抗人CD70单克隆抗体是肿瘤免疫治疗的潜在药物。附图说明图1：人CD70与食蟹猴CD70过表达CHO-K1稳定细胞系构建中使用的穿梭载体结构示意图，MCS为多克隆位点，靶基因插入此位置；图2：人和食蟹猴CD70过表达稳定细胞株的流式检测结果，图(1)中A柱形图代表CHO-K1母细胞，B柱形图代表人CD70过表达细胞株，图(2)中A柱形图代表CHO-K1母细胞，B柱形图代表食蟹猴CD70过表达细胞株(横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞数量)；图3：3只免疫小鼠在第3次免疫后第7天抗血清与人CD70重组蛋白间接ELISA反应效价结果(横坐标为抗血清稀释倍数，单位为千，纵坐标为波长450nm下光密度值(OD))；图4：3只免疫小鼠在第3次免疫后第7天抗血清与786-0肾癌细胞系结合流式检测结果，A柱形图代表PBS对照组，B、C、D柱形图分别代表#1、#2、#3小鼠抗血清(横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞数量)；图5：纯化的抗人CD70单克隆抗体变性还原SDS-PAGE电泳结果；图6：抗人CD70单克隆抗体亚型鉴定ELISA检测结果；图7：纯化的抗人CD70单克隆抗体与786-0肾癌细胞系结合流式检测结果，A柱形图代表PBS对照组，B柱形图代表一株商品化小鼠抗人CD70单抗，C柱形图代表本专利技术中纯化小鼠抗人CD70单抗(横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞数量)。具体实施方式下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。实施例1：人CD70和食蟹猴CD70过表达CHO-K1稳定细胞系构建1)穿梭载体构建人源CD70蛋白序列NP_001243CD70antigenisoform1[Homosapiens]MPEEGSGCSVRRRPYGCVLRAALVPLVAGLVICLVVCIQRFAQAQQQLPLESLGWDVAELQLNHTGPQQDPRLYWQGGPALGRSFLHGPELDKGQLRIHRDGIYMVHIQVTLAICSSTTASRHHPTTLAVGICSPASRSISLLRLSFHQGCTIASQRLTPLARGDTLCTNLTGTLLPSRNTDETFFGVQWVRP21,118Da，193aa，1-17为胞内域，18-38为跨膜螺旋，39-193为胞外域。食蟹猴CD70蛋白序列XP_0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.杂交瘤细胞株6F9，其特征在于，该杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO:C2019259。/n

【技术特征摘要】
1.杂交瘤细胞株6F9，其特征在于，该杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCCNO:C2019259。


2.权利要求1所述杂交瘤细胞株6F9产生的抗人CD70单克隆抗体。


3.根据权利要求2所述的抗人CD70单克隆抗体，其特征在于，其重链可变区的CDRH1为SEQIDNO：4所示氨基酸序列，CDRH2为SEQIDNO：6所示氨基酸序列，CDRH3为SEQIDNO：8所示氨基酸序列；其轻链可变区的CDRL1为SEQIDNO：12所示氨基酸序列，CDRL2为SEQIDNO：14所示氨基酸序列，CDRL3为SEQIDNO：16所示氨基酸序列。


4.根据权利要求2或3所述的抗人CD70单克隆抗体，其特征在于，其重链可变区为SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。


5.根据权利要求2或3所述的抗人CD70单克隆抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭志刚，黄子祥，杨洋，李梦晗，
申请(专利权)人：浙江蓝盾药业有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33