【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于高通量测序，具体涉及一种用于ngs文库制备的核酸接头及文库构建方法。
技术介绍
1、目前购买的ngs建库试剂盒，其进行的文库制备原理都是将一对特定的连接序列连接到dna片段的末端，以便能够通过仪器进行测序。大多数ngs接头包含三个功能域：(1)用于文库和克隆扩增的独特pcr引物退火序列，(2)独特的测序引物退火序列和(3)独特的样品索引序列。目前，大多数平台利用克隆扩增来制作每个dna文库分子的数百个副本。对于边合成边测序，用于测序引物的退火结构域与接头-插入接头并列；为了实现双末端测序，每个接头都拥有一个独特的引物退火序列。样本索引序列由独特的短序列组成，通常为6-8个碱基，在对其进行测序时，可识别特定序列读数的样本来源，从而使样本能够被多路复用或共同测序。通常，ngsdna文库的制备包括4个步骤：(1)dna片段化，(2)末端补平及加a，(3)接头连接，(4)文库扩增。
2、在本领域中仍然未知的是，由物理断裂产生的大量5'末端以未识别的方式被破坏并且不会被pnk磷酸化。常规末端补平混合物中没有酶可以修整受损的5'末端碱基。因此，制剂中的大部分dna片段不会转化为ngs文库分子，因为它们在5'末端与ngs接头的连接不相容。尽管本领域已知衔接子连接效率低，但连接通常同时在两条链上进行，因此仍不清楚哪条链是限制性的。本专利技术研究过程中将反应分成链特异性连接以分别测试每个反应的效率，发现：除了缺乏5'磷酸基团之外，导致ngs文库产量低的另一个因素是连接反应本身。在连接之前，通常使用缺乏3'-5'外切核酸酶
3、文库产量低的问题导致在ngs分析之前需要通过pcr扩增文库，这导致文库复杂性的损失和碱基组成偏差的引入。目前唯一避免此问题的解决方案是为文库制备增加大量的dna输入，但提交用于ngs分析的临床样本中高达20％的dna量不足，因此，应用额外的pcr循环来克服dna输入不足的问题。由于存在不可接受的pcr重复百分比，这会导致序列数据减少。
4、本专利技术主要解决的两个核心问题是：1)由于5’端未完全磷酸化可能会造成原始dna分子无法全部用于后续试验，导致产量变低。2)由于常规的连接反应导致t/a互连，产出较多的接头二聚体，导致反应效率下降，有效分子占比减少。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是，提供一种用于ngs文库制备的核酸接头及文库构建方法。旨在解决现有技术中ngs文库构建产量低、接头形成二聚物的技术问题。
2、本专利技术为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
3、一种用于ngs文库制备的核酸接头，该核酸接头通过对ngs接头进行修饰获得，所述修饰方式是在ngs接头的正链的3’端连接1-3个dutp，负链的相对应的5’端连接1-3个datp；同时核酸接头的两端采用磷酸化修饰或羟基化修饰。
4、使用dutp修饰的目的是：通过简单的dutp去除酶即可切割形成切口，反应迅速且效率较高。使用磷酸化或者是羟基化修饰核酸接头末端，可以避免二聚物的产生。
5、作为优选实施方案，所述ngs接头为y型接头。
6、作为优选实施方案，所述所述修饰方式是在ngs接头的正链的3’端连接2个dutp，负链的相对应的5’端连接2个datp。
7、作为优选实施方案，所述ngs接头的正链的核苷酸序列如seq id no.1所示，负链的核苷酸序列如seqidno.2所示。
8、作为优选实施方案，所述核酸接头连接的dutp采用ung酶进行切除，形成切口。
9、作为优选实施方案，使用链置换酶及延伸酶，dna聚合酶活性和5'→3'外切酶活性协同作用，使dna链上的切口向前推进。
10、作为优选实施方案，所述链置换酶及延伸酶为：dna聚合酶i、t7dna聚合酶中的一种或两种。
11、本专利技术还提供一种ngs文库构建方法，该方法利用本专利技术提供的核酸接头将dna片段进行接头连接。
12、本专利技术还提供一种ngs文库构建方法，所述文库构建方法包括如下步骤：
13、(1)对样本dna片段进行末端修复；
14、(2)利用提供的核酸接头将dna片段进行接头连接，并对连接反应产物进行纯化；
15、(3)去除核酸接头修饰的dutp，形成切口；
16、(4)用链置换酶及延伸酶，dna聚合酶活性和5'→3'外切酶活性协同作用，使dna链上的切口向前推进。
17、(5)对反应产物进行纯化，然后进行pcr扩增。
18、本专利技术还提供一种ngs测序方法，该方法包括：利用所述的ngs文库构建方法进行文库构建，将构建的文库进行高通量测序。
19、本专利技术还提供一种ngs文库构建试剂盒，该试剂盒包括本专利技术提供的核酸接头。
20、与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
21、1，本专利技术引入了增强的接头连接方法，该方法克服了在dna片段的5'末端添加磷酸基团的必要性。dna的物理断裂而受损的5'末端碱基被去除，通过去除受损的碱基，与5'磷酸盐连接兼容的碱基暴露出来，接头连接效率得以恢复，从而显著提高文库产量，同时提高通过较少的dna样本量构建文库的能力。此外，还引入了腺苷酸化/ta连接的替代方案，用于防止嵌合文库插入(连接过程中形成多联体)和形成接头二聚体连接产物，有助于提高文库制备产量。
22、2，本专利技术使用了修饰位点阻断方法，可以完全避免二聚体的产生，同时，考虑了后续分子的利用效率，使用切口平移，使得阻断位点有效去除，并最大化的使有损伤的片段避免因为没有5端磷酸化而不能进行有效连接。本专利技术重复避免了二聚体，同时最大化利用了原始的dna分子。
23、3，本专利技术方法采用常规的双链连接，只需要简单的操作即可，同时对于温度的要求较低，实验操作简单、成本也较低。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种用于NGS文库制备的核酸接头，其特征在于：所述核酸接头通过对NGS接头进行修饰获得，所述修饰方式是在NGS接头的正链的3’端连接1-3个dUTP，负链的相对应的5’端连接1-3个dATP；同时核酸接头的两端采用磷酸化修饰或羟基化修饰。
2.根据权利要求1所述的用于NGS文库制备的核酸接头，其特征在于：所述NGS接头为Y型接头。
3.根据权利要求1所述的用于NGS文库制备的核酸接头，其特征在于：所述所述修饰方式是在NGS接头的正链的3’端连接2个dUTP，负链的相对应的5’端连接2个dATP。
4.根据权利要求1所述的用于NGS文库制备的核酸接头，其特征在于：所述NGS接头的正链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，负链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.根据权利要求1所述的用于NGS文库制备的核酸接头，其特征在于：所述核酸接头连接的dUTP采用UNG酶进行切除，形成切口。
6.根据权利要求5所述的用于NGS文库制备的核酸接头，其特征在于：使用链置换酶及延伸酶，DNA聚合酶活性和5'→3'外切酶活性
7.根据权利要求6所述的用于NGS文库制备的核酸接头，其特征在于，所述链置换酶及延伸酶为：DNA聚合酶I、T7 DNA聚合酶中的一种或两种。
8.一种NGS文库构建方法，其特征在于：利用权利要求1～7任一项所述的核酸接头将DNA片段进行接头连接。
9.根据权利要求8所述的一种NGS文库构建方法，其特征在于，所述文库构建方法包括如下步骤：
10.一种NGS测序方法，其特征在于，该方法包括：利用权利要求8或9所述的NGS文库构建方法进行文库构建，将构建的文库进行高通量测序。
11.一种NGS文库构建试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括权利要求1～7任一项所述的核酸接头。
...【技术特征摘要】
1.一种用于ngs文库制备的核酸接头，其特征在于：所述核酸接头通过对ngs接头进行修饰获得，所述修饰方式是在ngs接头的正链的3’端连接1-3个dutp，负链的相对应的5’端连接1-3个datp；同时核酸接头的两端采用磷酸化修饰或羟基化修饰。
2.根据权利要求1所述的用于ngs文库制备的核酸接头，其特征在于：所述ngs接头为y型接头。
3.根据权利要求1所述的用于ngs文库制备的核酸接头，其特征在于：所述所述修饰方式是在ngs接头的正链的3’端连接2个dutp，负链的相对应的5’端连接2个datp。
4.根据权利要求1所述的用于ngs文库制备的核酸接头，其特征在于：所述ngs接头的正链的核苷酸序列如seq id no.1所示，负链的核苷酸序列如seq id no.2所示。
5.根据权利要求1所述的用于ngs文库制备的核酸接头，其特征在于：所述核酸接头连接的dutp采用ung...
【专利技术属性】
技术研发人员：秦资，李芳敏，祝君，张华，
申请(专利权)人：上海思路迪生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。