一种不依赖微流控芯片的超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法技术

本发明专利技术公开一种不依赖微流控芯片的超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法。该方法包括：对细胞进行固定处理和透化处理，得到细胞核；利用带有第一轮样本标签序列的特异性逆转录引物1，在细胞核原位逆转录合成mRNA‑cDNA杂合双链；利用Tn5转座子在mRNA‑cDNA杂合双链上添加测序接头；采用基于震荡的微滴包裹方法，使偶联捕获序列的凝珠与转座后的细胞核包裹在油包水结构中，得到微滴；利用预扩增引物对微滴内核酸片段进行文库预扩增，得到预文库；利用带有第二轮样本标签序列的引物2对预文库进行最终扩增，得到单细胞转录组测序文库。采用该方法，避免了对仪器平台的依赖，简化了反应流程，降低了反应成本，提高了单次反应检测的细胞数量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物，尤其涉及一种不依赖微流控芯片的超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法。

技术介绍

1、单细胞转录组测序技术对阐明组织中复杂多样的细胞个体在发育和功能等方面的异质性具有重要作用。目前有多种单细胞转录组方法发表，其中使用最为广泛的是smart-seq2(switching mechanism at 5’end of the rna transcript)技术和10×genomics公司的相关试剂盒。

2、smart-seq2在分选得到单细胞后，以胸腺嘧啶组成的核苷酸链(oligo(dt)vn)为引物进行逆转录，生成cdna第一链。当逆转录酶到达mrna 5’末端时，会在末端添加几个连续的胞嘧啶(c)残基。然后通过模板转换引物tso结合cdna，合成第二条链。cdna双链经过pcr扩增纯化后用于测序。该技术存在通量有限，操作繁琐的问题。

3、10x genomics公司依赖于自有商业平台，开发了一系列单细胞转录组测序试剂盒，但价格昂贵，并且受到仪器的限制。

4、因此，亟需开发一种高通量、低成本、流程简洁、不本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种不依赖微流控芯片的超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，包括步骤：

2.根据权利要求1所述的不依赖微流控芯片的超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，采用细胞固定液A对细胞进行固定处理，所述细胞固定液A的主要成分为乙二醛和乙酸。

3.根据权利要求1所述的不依赖微流控芯片的超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，采用细胞透化液B对细胞进行透化处理，所述细胞透化液B的主要成分为吐温-20，CA-630，Digitonin和RNA酶抑制剂。

4.根据权利要求1所述的不依赖微流控芯片的超高通量单细胞转录组测序文库的...

【技术特征摘要】

1.一种不依赖微流控芯片的超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，包括步骤：

2.根据权利要求1所述的不依赖微流控芯片的超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，采用细胞固定液a对细胞进行固定处理，所述细胞固定液a的主要成分为乙二醛和乙酸。

3.根据权利要求1所述的不依赖微流控芯片的超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，采用细胞透化液b对细胞进行透化处理，所述细胞透化液b的主要成分为吐温-20，ca-630，digitonin和rna酶抑制剂。

4.根据权利要求1所述的不依赖微流控芯片的超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，利用带有第一轮样本标签序列的特异性逆转录引物1，在所述细胞核原位逆转录合成mrna-cdna杂合双链的步骤，具体包括：

5.根据权利要求1或4所述的不依赖微流控芯片的超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，所述带有第一轮样本标签序列的特异性逆转录引物1为5’-cagacgtgtgctcttccgatct[8bp sample_idx1]nnnnnnnnnnttttttttttttttttttttttttttttttv n-3’。

6.根据权利要求4所述的不依赖微流控芯片的超高通量单细胞转录组...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈曦，徐玮，
申请(专利权)人：南方科技大学，
类型：发明
国别省市：