【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及一种不依赖微流控芯片的超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法。
技术介绍
1、单细胞转录组测序技术对阐明组织中复杂多样的细胞个体在发育和功能等方面的异质性具有重要作用。目前有多种单细胞转录组方法发表，其中使用最为广泛的是smart-seq2(switching mechanism at 5’end of the rna transcript)技术和10×genomics公司的相关试剂盒。
2、smart-seq2在分选得到单细胞后，以胸腺嘧啶组成的核苷酸链(oligo(dt)vn)为引物进行逆转录，生成cdna第一链。当逆转录酶到达mrna 5’末端时，会在末端添加几个连续的胞嘧啶(c)残基。然后通过模板转换引物tso结合cdna，合成第二条链。cdna双链经过pcr扩增纯化后用于测序。该技术存在通量有限，操作繁琐的问题。
3、10x genomics公司依赖于自有商业平台，开发了一系列单细胞转录组测序试剂盒，但价格昂贵，并且受到仪器的限制。
4、因此，亟需开发一种高通量、低成本、流程简洁、不依赖于商业化微流控芯片的超高通量单细胞转录组测序文库的构建技术。
技术实现思路
1、鉴于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种不依赖微流控芯片的超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，旨在解决现有技术存在通量有限，操作繁琐，或成本高的问题。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、一种不依赖微流控芯片
4、对细胞依次进行固定处理和透化处理，得到细胞核；
5、利用带有第一轮样本标签序列的特异性逆转录引物1，在所述细胞核原位逆转录合成mrna-cdna杂合双链；
6、利用tn5转座子在所述mrna-cdna杂合双链上添加测序接头；
7、采用基于震荡的微滴包裹方法，使偶联捕获序列的凝珠与转座后的细胞核包裹在油包水结构中，得到微滴；
8、利用预扩增引物对所述微滴中的核酸片段进行文库预扩增，得到预文库；
9、利用带有第二轮样本标签序列的引物2对所述预文库进行最终扩增，将最终扩增产物回收后，得到所述单细胞转录组测序文库。
10、可选地，采用细胞固定液a对细胞进行固定处理，所述细胞固定液a的主要成分为乙二醛和乙酸。
11、可选地，采用细胞透化液b对细胞进行透化处理，所述细胞透化液b的主要成分为吐温-20，ca-630，digitonin和rna酶抑制剂。
12、可选地，利用带有第一轮样本标签序列的特异性逆转录引物1，在所述细胞核原位逆转录合成mrna-cdna杂合双链的步骤，具体包括：
13、转移所述细胞核至反应混合物c中，在所述细胞核原位逆转录合成mrna-cdna杂合双链；
14、其中所述反应混合物c包括：rna酶抑制剂、用于增加分子作用频率的添加剂、带有第一轮样本标签序列的特异性逆转录引物1、无核酸酶水和逆转录酶。
15、可选地，所述带有第一轮样本标签序列的特异性逆转录引物1为5’-cagacgtgtgctcttccgatct[8bpsample_idx1]nnnnnnnnnnttttttttttttttttttttttttttttttvn-3’。
16、可选地，所述rna酶抑制剂包括2u/μl ribolock rnase inhibitor。
17、可选地，利用tn5转座子在所述mrna-cdna杂合双链上添加测序接头的步骤，具体包括：
18、转移完成逆转录的细胞核至反应混合物d中，在所述完成逆转录的细胞核的mrna-cdna杂合双链上添加测序接头；
19、其中所述反应混合物d包括：tn5转座子、无核酸酶水和tn5酶切反应体系。
20、可选地，所述tn5转座子为核酸序列为：5’-gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacag-3’与phos-c*t*g*t*c*t*c*t*t*a*t*a*c*a*c*a*t*c*/iinvdt/的退火产物；
21、或者，所述tn5转座子为核酸序列为：
22、5’-gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacag-3’
23、与phos-ctgtctcttatacacatc/iinvdt/的退火产物。
24、可选地，利用tn5转座子在所述mrna-cdna杂合双链上添加测序接头之后，还包括步骤：转移转座后的细胞核至反应混合物e中，以去除多余引物和补齐tn5酶切产生的dna-rna杂合双链缺口；
25、其中所述反应混合物e包括：核酸外切酶、逆转录酶、无核酸酶水和逆转录酶反应体系。
26、可选地，采用基于震荡的微滴包裹方法，使偶联捕获序列的凝珠与转座后的细胞核包裹在油包水结构中，得到微滴的步骤，具体包括：
27、将转座后的细胞核、偶联nextera r1捕获序列的聚丙烯凝珠和含有表面活性剂的油混合，进行震荡，得到所述微滴。
28、有益效果：本专利技术简化了转录组文库构建中cdna扩增步骤，不需要第二链的合成。本专利技术的单细胞转录组测序文库的构建方法不依赖于商业化微流控芯片，通过震荡凝珠、细胞和油，由于凝珠体积限制可以形成单细胞包裹的微滴，从而避免了对仪器平台的依赖，简化了反应的流程，降低了反应成本。通过两轮标签序列的添加，实现了过载的细胞液滴包裹上样，提高了单次反应检测的细胞数量，进一步降低了单细胞文库的制备成本，具有较高的普遍适用性。
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1.一种不依赖微流控芯片的超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，包括步骤：
2.根据权利要求1所述的不依赖微流控芯片的超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，采用细胞固定液A对细胞进行固定处理，所述细胞固定液A的主要成分为乙二醛和乙酸。
3.根据权利要求1所述的不依赖微流控芯片的超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，采用细胞透化液B对细胞进行透化处理，所述细胞透化液B的主要成分为吐温-20，CA-630，Digitonin和RNA酶抑制剂。
4.根据权利要求1所述的不依赖微流控芯片的超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，利用带有第一轮样本标签序列的特异性逆转录引物1，在所述细胞核原位逆转录合成mRNA-cDNA杂合双链的步骤，具体包括：
5.根据权利要求1或4所述的不依赖微流控芯片的超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，所述带有第一轮样本标签序列的特异性逆转录引物1为5’-CAGACGTGTGCTCTTCCGATCT[8bp sample_idx1]NNNNNNNN
6.根据权利要求4所述的不依赖微流控芯片的超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，所述RNA酶抑制剂包括2U/μl Ribolock Rnase inhibitor。
7.根据权利要求1所述的不依赖微流控芯片的超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，利用Tn5转座子在所述mRNA-cDNA杂合双链上添加测序接头的步骤，具体包括：
8.根据权利要求1或7所述的不依赖微流控芯片的超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，所述Tn5转座子为核酸序列为：5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3’与Phos-C*T*G*T*C*T*C*T*T*A*T*A*C*A*C*A*T*C*/iInvdT/的退火产物；
9.根据权利要求1所述的不依赖微流控芯片的超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，利用Tn5转座子在所述mRNA-cDNA杂合双链上添加测序接头之后，还包括步骤：转移转座后的细胞核至反应混合物E中，以去除多余引物和补齐Tn5酶切产生的DNA-RNA杂合双链缺口；
10.根据权利要求1所述的不依赖微流控芯片的超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，采用基于震荡的微滴包裹方法，使偶联捕获序列的凝珠与转座后的细胞核包裹在油包水结构中，得到微滴的步骤，具体包括：
...【技术特征摘要】
1.一种不依赖微流控芯片的超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，包括步骤：
2.根据权利要求1所述的不依赖微流控芯片的超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，采用细胞固定液a对细胞进行固定处理，所述细胞固定液a的主要成分为乙二醛和乙酸。
3.根据权利要求1所述的不依赖微流控芯片的超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，采用细胞透化液b对细胞进行透化处理，所述细胞透化液b的主要成分为吐温-20，ca-630，digitonin和rna酶抑制剂。
4.根据权利要求1所述的不依赖微流控芯片的超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，利用带有第一轮样本标签序列的特异性逆转录引物1，在所述细胞核原位逆转录合成mrna-cdna杂合双链的步骤，具体包括：
5.根据权利要求1或4所述的不依赖微流控芯片的超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，所述带有第一轮样本标签序列的特异性逆转录引物1为5’-cagacgtgtgctcttccgatct[8bp sample_idx1]nnnnnnnnnnttttttttttttttttttttttttttttttv n-3’。
6.根据权利要求4所述的不依赖微流控芯片的超高通量单细胞转录组...
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