【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学，特别涉及一种外泌体膜蛋白选择性共价标记探针及应用。
技术介绍
1、外泌体是一种由细胞分泌的纳米级细胞外囊泡，直径在30-150 nm左右。外泌体结构类似于缩小版的细胞，膜表面含有母体细胞来源的蛋白质，但内部没有任何细胞器。外泌体膜蛋白具有极高的研究价值。一方面，外泌体膜蛋白参与复杂的细胞间通讯与信号转导，另一方面，癌细胞来源外泌体上的膜蛋白可作为癌症标志物，是非侵入性液体活检的检测对象之一。此外，外泌体作为一种天然的生物囊泡，具有极好的生物相容性，其表面的结构与蛋白使得外泌体可以减少免疫清除并具有一定的归巢递送能力，是药物递送极有潜力的载体。
2、鉴于外泌体膜蛋白研究的重要性，科研人员需要对外泌体膜蛋白进行修饰，尤其是对外泌体膜表面特定蛋白选择性标记或修饰越发重要。选择性标记最直接的应用方向就是针对外泌体膜蛋白标志物的疾病检测。选择性修饰可以修改膜蛋白信号，从而研究并调控外泌体的生物学功能。选择性修饰还可以用于分离特殊群体的外泌体，研究外泌体的异质性。
3、核酸是生命的遗传信息的载体。但随着对核酸分子结构研究的深入，核酸分子越来越多的非遗传功能被不断开发，如生物传感、生物成像、靶向递送、疾病治疗等。基于dna构建的功能核酸的优势在于较强的设计性，修饰性，以及与各种新型材料的兼容性，包括无机纳米材料，蛋白质，脂质体，外泌体等。因此，将dna的丰富功能与外泌体结合，对外泌体的膜蛋白进行特异性的dna修饰具有重要的意义。
4、目前针对外泌体膜蛋白的修饰方法主要包括两大类。第一
5、基于化学共价修饰的方法虽然简便快捷，但共价交联分子无差别地修饰在各类膜蛋白上，缺乏选择性，即无法对外泌体上特定的一种蛋白分子进行选择性的标记或修饰。当需要精准地标记与示踪某种外泌体膜蛋白并研究其生物学功能时，这些方法都无法做到。而基于核酸适体特异性识别的标记方法，由于这种识别与结合方式是非共价的，因此缺乏稳定性，尤其是在复杂的生物环境中。由于外泌体小尺寸导致其可能只含有几个拷贝数量的待标记蛋白，这种非共价标记的效率问题会变得更加严重。总之，目前缺乏实现外泌体膜蛋白选择性dna共价修饰的方法。
技术实现思路
1、针对上述问题，通过使用光控的双吖丙啶基团（diazirine）作为交联基团，在核酸适体识别外泌体膜蛋白后，再激发光控基团与靶标蛋白发生共价反应，即可实现对外泌体特定膜蛋白的共价修饰。反应完成后，用cdna将核酸适体竞争掉落，这样就实现了在特定膜蛋白上修饰一条dna链。
2、本申请的技术方案如下：
3、一种外泌体膜蛋白选择性共价标记探针，包括两条dna链；所述的两条dna链，一条为核酸适体链，一条为光控反应链；所述的核酸适体靶向外泌体膜蛋白cd24；所述的光控反应链的3’端修饰有双吖丙啶基团；
4、所述的核酸适体链的碱基序列如seq id no.1所示；具体为：5’-tatgtgg gtgggtgggcggttatgctgagtcagccttgcttttatgaaggacgatgtatgatgctagca-3’；
5、所述的光控反应链的碱基序列如seq id no.2所示；具体为：5’-gaccctaagcatacatcgtccttacttttttt-diazirine-3’。
6、上述两条dna链通过下划线部分实现互补。
7、更进一步地，所述的核酸适体与光控反应链的加入量的摩尔比为1-1.5：1。
8、上述外泌体膜蛋白选择性共价标记探针的制备方法，包括以下步骤：
9、（1）光控反应链的制备：
10、（2）将核酸适链、步骤（1）的光控反应链混合后室温培养，得到外泌体膜蛋白选择性共价标记探针。
11、优选地，步骤（1）的过程为：
12、s1 光控反应链前体、乙腈、n,n-二甲基甲酰胺dmf，琥珀酰亚胺4,4'-叠氮戊酸或nhs-双吖丙啶，三乙胺（tea）在室温摇床反应；
13、s2 然后进行dna盐析沉淀，加入醋酸钠缓冲液，冰乙醇， tea，在温度：小于等于-80 ℃下，反应30-60 min；离心，吸出上清液，底部沉淀用三乙胺乙酸缓冲液溶解，hplc纯化；和/或
14、所述的光控反应链前体的碱基序列如seq id no.2所示；具体为：5’-gaccctaagcatacatcgtccttactttttt-nh2-3’。
15、优选地，步骤（2）hplc纯化的条件为：hplc缓冲液：a相，0.1 m 三乙胺乙酸缓冲液；b相，乙腈；
16、hplc程序：0-4min，95% a相，5% b相；4 -30 min 梯度，a相90% -35%，b相10% -65%；30 min-40 min，95% b相，5% a相；
17、信号监测：波数260 nm。
18、本专利技术的另一个目的，保护一种外泌体膜蛋白选择性共价标记的方法，采用上述外泌体膜蛋白选择性共价标记探针或上述制备方法制备得到的外泌体膜蛋白选择性光控共价标记探针。
19、优选地，通过dna链式反应hcr在共价标记的外泌体膜蛋白上实现膜蛋白信号放大检测。
20、本申请的概念设计原理如图1所示，本申请提供了一种基于核酸适体介导的邻近标记策略用于外泌体膜蛋白的选择性共价标记。邻近反应即“识别后反应”，可实现位点选择性反应，其基本原理是通过配体受体的特异性识别，拉近反应物与底物，在复杂生物系统中实现有选择性的共价反应。核酸适体体积小，可编辑性和设计性强，适用于开发邻近反应。核酸适体优秀的靶向能力，可拉近反应链与靶蛋白，实现靶蛋白的共价修饰。为了精准地实现这种“识别后再反应”，减少非特异性反应，使用的交联基团是光控的双吖丙啶基团（diazirine），这是一种光激活的反应基团，在紫外光照射下会与附近的蛋白发生共价反应。在核酸适体识别外泌体膜蛋白后，再激发光控基团与靶标蛋白发生共价反应，即可实现对外泌体特定膜蛋白的共价修饰。反应完成后，用cdna将核酸适体竞争掉落，这样就实现了在特定膜蛋白上修饰一条dna链 (cdna是与核酸适体的碱基完全互补的dna链，它与核酸适体的结合更强，所以会竞争核酸适体与蛋白的结合，最终核酸适体从蛋白上掉落与cdna结合)。
21、本专利技术的有益效果：
22、（1）与传统的共价化学修饰相比，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种外泌体膜蛋白选择性共价标记探针，其特征在于，包括两条DNA链；所述的两条DNA链，一条为核酸适体链，一条为光控反应链；
2.根据权利要求1所述的外泌体膜蛋白选择性共价标记探针，其特征在于，所述的核酸适体与光控反应链的加入量的摩尔比为1-1.5：1。
3.权利要求1或2所述的外泌体膜蛋白选择性共价标记探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）的过程为：
5. 根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）HPLC纯化的条件为：HPLC缓冲液：A相，0.1 M 三乙胺乙酸缓冲液；B相，乙腈；
6.一种外泌体膜蛋白选择性共价标记的方法，其特征在于，采用权利要求1或2所述的外泌体膜蛋白选择性共价标记探针或权利要求3-5任一所述的制备方法制备得到的外泌体膜蛋白选择性共价标记探针靶向外泌体膜蛋白CD24。
7.根据权利要求6所述的外泌体膜蛋白选择性共价标记的方法，其特征在于，通过DNA链式反应HCR在共价标记的外泌体膜蛋白上实现膜蛋白信号放大检测
...【技术特征摘要】
1.一种外泌体膜蛋白选择性共价标记探针，其特征在于，包括两条dna链；所述的两条dna链，一条为核酸适体链，一条为光控反应链；
2.根据权利要求1所述的外泌体膜蛋白选择性共价标记探针，其特征在于，所述的核酸适体与光控反应链的加入量的摩尔比为1-1.5：1。
3.权利要求1或2所述的外泌体膜蛋白选择性共价标记探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）的过程为：
5. 根据权利要求3或4所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：李进，俞鑫权，渠凤丽，
申请(专利权)人：中国科学院基础医学与肿瘤研究所筹，
类型：发明
国别省市：
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