【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，涉及基因编辑技术、细胞外囊泡及病毒感染疾病的治疗领域，具体涉及一种表面表达特定病毒受体，内部装载针对病毒的基因编辑系统的细胞外囊泡，该囊泡的制备方法及抗病毒应用。
技术介绍
1、病毒一直是人类健康的重大威胁，病毒感染严重威胁着人类的健康。
2、除了sars-cov-2和hbv外，人类与病毒的斗争从未间断。但当人类进入“地球村”时代，对病毒的特异性杀伤问题，是全人类必须解决的重要生物安全问题。然而，针对包括sars-cov-2在内的病毒所导致的疾病仍无特效药，寻求针对病毒的特异性杀伤技术都是极其重要且亟待解决的课题。
3、病毒进入宿主体内后，通常与细胞膜上的受体结合，入侵宿主细胞并导致疾病。例如新型冠状病毒(sars-cov-2)，与细胞膜上的受体——ace2结合，入侵表达该受体的宿主细胞。乙肝病毒(hbv)可以通过识别肝细胞膜上的ntcp，从而侵入和感染宿主细胞。
4、近年兴起的基因编辑技术包括：锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应子(talen)和规律成簇的间隔短回文重复(crispr)等。该技术使得人们可以对dna 或者rna在精准位点进行切割，替换等编辑，有广阔的应用前景。专利技术人也一直在研究被比作"基因剪刀"的crispr-cas9基因编辑技术，并在安全性方面对改技术进行了优化(参见文献：jiang,j.,zeng,t.,et.al.(2022).optimization of cas9 rna sequence to reduce itsunexpect
5、细胞外囊泡(extracellular vesicles,evs)是从细胞产生的双层膜结构的囊泡状小体，可以包含rna，蛋白质等活性物质，是细胞间交流的重要载体，用于多种疾病的治疗的前景巨大，是近年研究的一个热点。但细胞外囊泡联合基因编辑技术是否可能用于病毒的治疗性研究，目前未见报道。
技术实现思路
1、基于上述背景，本专利技术提出一种全新的病毒杀伤策略：针对特定病毒开发“陷阱”型细胞外囊泡("trap"extracellular vesicles，t-evs)，其表面含有高水平的病毒受体，囊泡内含针对该病毒核酸的基因编辑系统，对病毒核酸进行编辑(图1)。
2、该t-evs有望实现预防特定病毒感染，抑制病毒播散，甚至实现疾病治疗的目的。以新型冠状病毒为例，为其设计制造的t-evs像一个个陷阱一样，凭借表面布满的 sars-cov-2受体(如ace2)，竞争性吸引sars-cov-2核酸物质进入囊泡，并被囊泡内部的基因编辑系统(grna和cas13d)特异切割，实现病毒被精准“杀伤”的目的。
3、本专利技术的第一方面，提供了一种特异性杀伤病毒的细胞外囊泡，该细胞外囊泡表面含有与病毒特异性结合的病毒受体，囊泡内含切割病毒核酸的基因编辑系统。
4、优选的，本专利技术所述的细胞外囊泡是生物囊泡，包括外泌体、微泡等细胞天然分泌的囊泡状体。
5、优选的，病毒为dna病毒或rna病毒。dna病毒如乙肝病毒、天花病毒、水痘- 带状疱疹病毒、eb病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒等；rna病毒如艾滋病病毒、丙型肝炎病毒、乙型脑炎病毒、流感病毒、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、登革热病毒、轮状病毒、sars病毒、莫斯病毒、埃博拉病毒、新型冠状病毒等。
6、病毒受体选自细胞膜上与病毒结合的受体也可以是与病毒表面抗原特异性结合的抗体。如细胞表面与sars-cov-2病毒特异性结合的ace2蛋白，乙肝病毒入侵人体细胞的受体——ntcp(牛磺胆酸钠共转运蛋白)。
7、基因编辑系统包括但不限于crispr基因编辑系统、锌指核酸酶(zfn)系统及转录激活因子样效应子(talen)系统中的一种。
8、在本专利技术的优选实施例中，我们使用的是crispr系统：如针对新冠病毒特有的rna序列，我们设计了识别该病毒rna的grna&cas13d系统，并制备了内部包含该系统的t-ev；针对乙肝病毒(hbv)病毒特有的dna序列，设计了识别该病毒dna 的grna&cas9系统，并制备了内部包含该系统的t-ev。
9、其他基因编辑系统同样适用于本专利技术：例如针对dna病毒，锌指核酸酶(zfn) 系统和转录激活因子样效应子(talen)系统，一样可以达到crispr系统的效果，(参见文献:赵国华,浦佳丽,唐北沙.zfn,talen和crispr/cas9基因编辑技术在疾病研究及基因治疗中的应用[j].中华医学遗传学杂志,2016,33(6):6.以及rui y,wilson dr, green jj.non-viraldelivery to enable genome editing.trends biotechnol.2019 mar；37(3):281-293.pmid:30278987)。
10、本专利技术构建的“陷阱”型细胞外囊泡("trap"extracellular vesicles，t-evs)实现了在病毒感染或者疫情爆发前提前准备好应对大类病毒的t-ev。比如，可以通过生物信息学比对所有已知的冠状病毒的序列，找出冠状病毒共有的序列，然后针对这种一大类病毒共有的序列设计crispr-cas13基因编辑系统，然后据此设计的t-ev就可以应对冠状病毒这一大类病毒，而不仅仅是新型冠状病毒这一亚类，而且可以设计多条grna，这样就可以有效应对病毒变异，因为病毒在几个位点都突变的概率就大为降低。
11、例如，针对冠状病毒，设计的grna包括下述序列中的任意一种或多种组合：
12、cov-grna-1：auauaugugguaccaugucacc(seq id no.1)；
13、cov-本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种特异性杀伤病毒的细胞外囊泡，该细胞外囊泡表面含有与病毒特异性结合的病毒受体，囊泡内含切割病毒核酸的基因编辑系统。
2.根据权利要求1所述的特异性杀伤病毒的细胞外囊泡，其特征在于，所述病毒为DNA病毒或RNA病毒。
3.根据权利要求1所述的特异性杀伤病毒的细胞外囊泡，其特征在于，所述病毒受体选自细胞膜上与病毒结合的受体或与病毒表面抗原特异性结合的抗体。
4.根据权利要求1所述的特异性杀伤病毒的细胞外囊泡，其特征在于，所述基因编辑系统包括但不限于CRISPR基因编辑系统、锌指核酸酶系统及转录激活因子样效应子系统中的一种。
5.根据权利要求2所述的特异性杀伤病毒的细胞外囊泡，其特征在于：
6.权利要求1～5任一项所述的特异性杀伤病毒的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.权利要求1～5任一项所述的特异性杀伤病毒的细胞外囊泡在制备抗病毒药物中的应用。
8.权利要求1～5任一项所述的特异性杀伤病毒的细胞外囊泡在抗病毒治疗中的应用。
9.一种抗病毒药物组合物，其特征在于，包
10.根据权利要求9所述的抗病毒药物组合物，其特征在于，所述活性成分中以特异性杀伤病毒的细胞外囊泡作为唯一活性成分。
11.根据权利要求9所述的抗病毒药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为注射剂、雾化吸入剂或片剂。
12.一种抗病毒治疗方法，其特征在于，包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种特异性杀伤病毒的细胞外囊泡，该细胞外囊泡表面含有与病毒特异性结合的病毒受体，囊泡内含切割病毒核酸的基因编辑系统。
2.根据权利要求1所述的特异性杀伤病毒的细胞外囊泡，其特征在于，所述病毒为dna病毒或rna病毒。
3.根据权利要求1所述的特异性杀伤病毒的细胞外囊泡，其特征在于，所述病毒受体选自细胞膜上与病毒结合的受体或与病毒表面抗原特异性结合的抗体。
4.根据权利要求1所述的特异性杀伤病毒的细胞外囊泡，其特征在于，所述基因编辑系统包括但不限于crispr基因编辑系统、锌指核酸酶系统及转录激活因子样效应子系统中的一种。
5.根据权利要求2所述的特异性杀伤病毒的细胞外囊泡，其特征在于：
6.权利要求1～5任一项所述的特异性杀伤病毒的...
【专利技术属性】
技术研发人员：王越，蒋俊锋，黎力，金杞树，刘延刚，张莉，赵平，
申请(专利权)人：中国人民解放军海军军医大学，
类型：发明
国别省市：
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