【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体地说，是一种多重呼吸道病毒联合检测的引物探针集及数字液滴pcr检测试剂盒。
技术介绍
1、呼吸道传染病的症状大多表现为发热、发力、患者全身酸痛、头痛等呼吸道症状，对各种病原体的鉴别需要大量的实验筛查，耗时耗力。针对新型传染源在新环境中初现时，快速、低成本的病原体多重检测对于遏制传播至关重要。目前已有部分方法或实际可实现多重pcr法用于检测呼吸道病原体，但是存在通量低且无法实现低丰度核酸的精确定量。建立一种高效、高灵敏度的呼吸道病毒的多重数字液滴pcr检测方法，对患者的精确诊断及后续的精确治疗具有极大的帮助。
技术实现思路
1、封闭性环境导致传染病扩散极快，为避免最长潜伏期的检疫过程，本专利技术设计专利技术一种针对呼吸道病毒的多重联检试剂盒，可实现高通量、高敏感、高特异性同时检测四种常见呼吸道传染病病毒的携带者，避免造成传染病的快速扩散。本专利技术所要解决的技术问题在于克服现有的多重呼吸道病毒检测的不足，提供一种甲型流感病毒(flua)、乙型流感病毒(flub)、人呼吸道合胞病毒(rsv)、新冠病毒(sars-cov-2)核酸联合检测试剂盒。本专利技术的试剂盒检测通量高、可实现低丰度核酸准确定量、检测灵敏度高、重复性好、特异性强、操作简便、可以在2-3小时内提供准确检测结果，能够同时准确鉴别不同病毒感染引起的呼吸道感染，从而实现对患者的精确诊断及后续的精确治疗。
2、为了实现上述目的，本专利技术的第一方面，提供一种多重呼吸道病毒联合检测的引物探针集
3、进一步地，所述的引物探针集包括(如表1所示)：
4、a)用于检测甲型流感病毒m(matrix protein 2and matrix protein 1)基因的引物对和taqman探针，其核苷酸序列依次如seq id no.1～seq id no.3所示；
5、b)用于检测乙型流感病毒nep-ns1(nuclear export protein andnonstructural protein)基因的引物对和taqman探针，其核苷酸序列依次如seq id no.4～seq id no.6所示；
6、c)用于检测人呼吸道合胞病毒m(matrix protein)基因的引物对和taqman探针，其核苷酸序列依次如seq id no.7～seq id no.9所示；
7、d)用于检测新冠病毒orf1ab(open reading frame)基因的引物对和taqman探针，其核苷酸序列依次如seq id no.10～seq id no.12所示；
8、e)用于检测新冠病毒n(nucleoprotein)基因的引物对和taqman探针，其核苷酸序列依次如seq id no.13～seq id no.15所示；
9、f)用于检测内标gapdh基因的引物对和taqman探针，其核苷酸序列依次如seq idno.16～seq id no.18所示。
10、进一步地，所述的探针的5’端标记fam、atto425、vic、rox、cy5或cy7，3’端标记bhq1、bhq2或bhq3。
11、更进一步地，seq id no.3所示探针的5’端标记fam荧光发生基团，3’端标记bhq1淬灭基团；
12、seq id no.6所示探针的5’端标记atto425荧光发生基团，3’端标记bhq1淬灭基团；
13、seq id no.9所示探针的5’端标记cy5荧光发生基团，3’端标记bhq3淬灭基团；
14、seq id no.12所示探针的5’端标记vic荧光发生基团，3’端标记bhq1淬灭基团；
15、seq id no.15所示探针的5’端标记cy7荧光发生基团，3’端标记bhq3淬灭基团；
16、seq id no.18所示探针的5’端标记rox荧光发生基团，3’端标记bhq2淬灭基团。
17、本专利技术的第二方面，提供如上所述的引物探针集在制备呼吸道病毒联合检测产品中的用途。
18、进一步地，所述的呼吸道病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、人呼吸道合胞病毒、和新冠病毒。
19、进一步地，所述的甲型流感病毒包括h1n1和h3n2。
20、进一步地，所述的乙型流感病毒包括yamagata系和victoria系。
21、进一步地，所述的人呼吸道合胞病毒包括a和b两个亚型。
22、本专利技术的上述引物探针集，能够一次性高效鉴别并准确定量甲型流感病毒、乙型流感病毒、人呼吸道合胞病毒、新冠病毒，检测灵敏度高、重复性好、特异性强。
23、甲型流感病毒中h1n1、h2n2、h3n2主要感染人类，其中h1n1和h3n2是引起季节型流感的主要亚型，其它许多亚型的自然宿主是多种禽类和动物。本专利技术所述甲型流感病毒检测包括甲型流感病毒h1n1和h3n2，甲型流感病毒引物探针对以m基因相对保守序列为靶标设计，甲型流感病毒h1n1和h3n2具有该共同序列，本专利技术选择区域流行株的m基因核酸序列进行比对分析，引物探针对针对保守序列区域为靶标设计，因此该引物可以检测甲型流感病毒h1n1和h3n2。
24、所述乙型流感病毒包括乙型流感病毒yamagata系和victoria系，乙型流感病毒引物探针对以nep-ns1基因相对保守序列为靶标设计，乙型流感病毒yamagata系和victoria系具有该共同序列，本专利技术选择乙型流感病毒代表株的nep-ns1基因核酸序列进行比对分析，引物探针对针对保守序列区域为靶标设计，因此该引物可以检测乙型流感病毒yamagata系和victoria系。
25、所述人呼吸道合胞病毒包括a和b两个亚型，人呼吸道合胞病毒引物探针对以m基因相对保守序列为靶标设计，人呼吸道合胞病毒a和b两个亚型具有该共同序列，本专利技术选择人呼吸道合胞病毒a和b两个亚型的m基因核酸序列进行比对分析，引物探针对针对保守序列区域为靶标设计，因此该引物可以检测人呼吸道合胞病毒a和b两个亚型。
26、所述新冠病毒检测基因包括orf1ab和n基因，本专利技术选择新冠病毒orf1ab、n基因核酸序列进行比对分析，引物探针对针对保守序列区域为靶标设计，所设计的引物可分别用于检测新冠病毒orf1ab、n基因。
27、本专利技术所有的探针tm值接近且高于引物tm值，引物的tm值也接近相同53～55℃，确保扩增过程中引物和探针与目标序列的结合。
28、本专利技术的第三方面，提供一种联合检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、人呼吸道合胞病毒、新冠病毒的数字液滴pcr检测试剂盒，所述的数字液滴pcr检测试剂盒中包括多重数字液滴pcr反应物，所述多重数字液滴pcr反应本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多重呼吸道病毒联合检测的引物探针集，其特征在于，所述的引物探针集包括甲型流感病毒检测PCR引物探针、乙型流感病毒检测PCR引物探针、人呼吸道合胞病毒检测PCR引物探针、新冠病毒检测PCR引物探针、和内标GAPDH基因的引物探针：
2.根据权利要求1所述的引物探针集，其特征在于，所述的探针的5’端标记FAM、Atto425、VIC、ROX、Cy5或Cy7，3’端标记BHQ1、BHQ2或BHQ3。
3.根据权利要求2所述的引物探针集，其特征在于，SEQ ID NO.3所示探针的5’端标记FAM荧光发生基团，3’端标记BHQ1淬灭基团；
4.如权利要求1-3任一所述的引物探针集在制备呼吸道病毒联合检测产品中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的呼吸道病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、人呼吸道合胞病毒、和新冠病毒。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的甲型流感病毒包括H1N1和H3N2；所述的乙型流感病毒包括Yamagata系和Victoria系；所述的人呼吸道合胞病毒包括A和B两个亚型
7.一种联合检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、人呼吸道合胞病毒、新冠病毒的数字液滴PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的数字液滴PCR检测试剂盒中包括多重数字液滴PCR反应物，所述多重数字液滴PCR反应物包括如权利要求1-3任一所述的引物探针集。
8.根据权利要求7所述的数字液滴PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的多重数字液滴PCR反应物中还包括PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、ROX染料、无核酶水和/或外源内标引物探针对。
9.根据权利要求7所述的数字液滴PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括RNA提取试剂、RNA反转录试剂、阳性质控品、阴性质控品中的一种或两种以上。
10.根据权利要求9所述的数字液滴PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性质控品为含各目标病毒特异核酸序列和外源内标GAPDH特异核酸片段的质粒；所述的阴性质控品为无核酶水。
...【技术特征摘要】
1.一种多重呼吸道病毒联合检测的引物探针集，其特征在于，所述的引物探针集包括甲型流感病毒检测pcr引物探针、乙型流感病毒检测pcr引物探针、人呼吸道合胞病毒检测pcr引物探针、新冠病毒检测pcr引物探针、和内标gapdh基因的引物探针：
2.根据权利要求1所述的引物探针集，其特征在于，所述的探针的5’端标记fam、atto425、vic、rox、cy5或cy7，3’端标记bhq1、bhq2或bhq3。
3.根据权利要求2所述的引物探针集，其特征在于，seq id no.3所示探针的5’端标记fam荧光发生基团，3’端标记bhq1淬灭基团；
4.如权利要求1-3任一所述的引物探针集在制备呼吸道病毒联合检测产品中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的呼吸道病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、人呼吸道合胞病毒、和新冠病毒。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的甲型流感病毒包括h1n1和h3n2；所述的乙型流...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹广文，施艺玮，方乐天，赵佳怡，金怡，蒲蕊，夏江，
申请(专利权)人：中国人民解放军海军军医大学，
类型：发明
国别省市：
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