【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其是涉及一种空载的mhci的制备方法及其应用。
技术介绍
1、主要的组织相容性复合体(major histocompatibility complex，mhc)是在不同的物种中发现的一组基因，它能够编码一系列与免疫和非免疫相关的分子。mhc编码的糖蛋白在抗原呈递过程中将抗原肽呈递到细胞表面，被t淋巴细胞表面的t细胞受体(t cellreceptor，tcr)识别后，能够激活t淋巴细胞特异性的杀伤靶细胞，如感染病原体的细胞和癌细胞。根据mhc分子的结构，细胞内的产生途径，以及识别它们的t淋巴细胞类型，主要将其分为两类：ⅰ类和ⅱ类。mhci类和ⅱ类分子的功能相似：它们分别在细胞表面向cd8+和cd4+t细胞呈递抗原肽，但这些抗原肽的来源不同，mhci类分子主要呈递细胞内的肽，而mhcii类分子主要呈递外源性的肽。
2、mhci类分子是一种存在于几乎所有有核细胞中的膜表面蛋白，其功能是将胞浆和细胞核中经蛋白酶降解得到的抗原肽呈递到细胞表面。细胞毒性t淋巴细胞(cytotoxic tlymphocytes,ctls)通过tcr识别mhci类分子呈递的抗原肽后，特异性的裂解靶细胞。因此，mhci类分子对于抗原特异性t细胞的检测是非常重要的。
3、限制mhci类分子对抗原特异性t细胞检测的主要制约因素是tcr和肽-mhc(mhc-peptide complexes，pmhc)结合具有较低亲和力和较快的解离速率。正是由于这个原因，用单个pmhc对t细胞进行染色通常是不成功的。因此需要每个tcr分子
4、然而，这一方法也存在一定的缺陷。由于未结合抗原肽的mhci类分子是不稳定的，因此在构建重组的pmhc时，需要在重折叠的起始步骤中加入一个特异性t细胞的抗原表位(即抗原肽)，最后得到一种能够对特异性t细胞染色的pmhc。该方法耗时且步骤较为繁琐，无法高通量的产生不同的pmhc，限制了此技术的应用。为了解决上述问题，研究人员后续又开发了肽交换和二硫键稳定mhc分子生成四聚体的方法。这些方法虽然都极大的促进了高通量的产生不同的pmhc，但是也都存在各自的问题，比如利用肽交换方法生成四聚体时，必须先进行肽交换然后才能进行pmhc单体的四聚化，进行大规模pmhci多聚体文库的制备繁琐耗时；二硫键稳定的mhc方法在复性时需要加入10mm的二肽，高浓度二肽的加入无疑将增加生产四聚体的成本。因此，如何改进空载mhci类的多聚体复合物是有待解决的问题。
5、有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种空载的mhci的制备方法，该制备方法能够获得稳定的空载的mhci。本专利技术的另一目的在于提供该空载的mhci的制备方法制备得到的空载的mhci及其应用。
2、为解决上述技术问题，本专利技术特采用如下技术方案：
3、第一方面，提供了一种空载的mhci的制备方法，该制备方法包括将分离的mhc分子α链，分离的mhc分子β2m链和紫外光敏感的多肽混合并复性，得到肽-mhc，然后经紫外光照射使紫外光敏感的多肽断裂从肽-mhc中解离，获得空载的mhci。
4、可选地实施方式中，mhc分子α链和/或mhc分子β2m还包括至少一个氨基酸的突变。
5、可选地实施方式中，所述mhc分子α链选自mhc分子α链的胞外区。
6、可选地实施方式中，所述mhc分子α链胞外区为hla-a、hla-b或hla-c的α链胞外区。
7、可选地实施方式中，所述mhc分子α链胞外区的第84位和139位氨基酸残基为半胱氨酸。
8、可选地实施方式中，所述空载的mhci连接有示踪标记物；所述示踪标记物优选包括荧光素。
9、可选地实施方式中，所述空载的mhci和示踪标记物通过特异性结合对连接。
10、可选地实施方式中，所述空载的mhci是多聚体。
11、可选地实施方式中，所述空载的mhci是二聚体、三聚体或四聚体。
12、可选地实施方式中，第一结合分子连接于mhc单体，第二结合分子结合至少两个第一结合分子，使mhc单体形成多聚体；所述第一结合分子和第二结合分子组成特异性结合对。
13、可选地实施方式中，所述第二结合分子与示踪标记物连接。
14、可选地实施方式中，所述第一结合分子选自生物素，所述第二结合分子选自链霉亲和素。
15、可选地实施方式中，所述紫外光的波长大于等于紫外光敏感的多肽的断裂阈值。
16、可选地实施方式中，所述紫外光的波长大于等于360nm，紫外光的照射时间为30-60min。
17、可选地实施方式中，在复性缓冲液中将分离的mhc分子α链，分离的mhc分子β2m链和紫外光敏感的多肽混合复性，所述复性缓冲液包括：50～200mm tris-hcl、300～500mm精氨酸、1～5mm edta、1～10mm还原性谷胱甘肽、0.1～1mm氧化型谷胱甘肽和0.1～1mm苯甲基磺酰氟。
18、可选地实施方式中，mhc单体含有可生物素化序列。
19、可选地实施方式中，可生物素化序列包括氨基酸序列如seq id no.9所示的avi-tag，所述avi-tag融合与mhc分子α链的c端。
20、可选地实施方式中，所述制备方法包括将分离的含有可生物素化序列的mhc分子α链、分离的mhc分子β链和紫外光敏感的多肽混合复性，得到肽-mhc，然后将所述肽-mhc分子生物素化，使mhc单体标记有生物素，然后经紫外光照射获得标记有生物素的空载的mhc单体。
21、可选地实施方式中，所述制备方法包括如下步骤：
22、(a)表达和纯化在c端连接avi-tag序列的mhc分子α链胞外区和/或mhc分子β2m链；
23、(b)将步骤(a)获得的在c端连接avi-tag序列的mhc分子α链胞外区和mhc分子β2m链与紫外光敏感的多肽混合并复性，制备pmhc；
24、(c)将步骤(b)制备的pmhc生物素化，获得生物素化的pmhc；
25、(d)将步骤(c)获得的经生物素化的pmhc经过波长大于360nm紫外照射后，获得空载的mhci单体；
26、(e)将步骤(d)获得的生物素化空载的mhci单体与带示踪标记物的链霉亲和素反应，制备空载的mhci类分子的四聚体。
27、第二方面，还提供了第一方面的制备方法制本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种空载的MHCI的制备方法，其特征在于，将分离的MHC分子α链，分离的MHC分子β2m链和紫外光敏感的多肽混合并复性，得到肽-MHC，然后经紫外光照射使紫外光敏感的多肽断裂从肽-MHC中解离，获得空载的MHCI。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，MHC分子α链和/或MHC分子β2m还包括至少一个氨基酸的突变；
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述空载的MHCI连接有示踪标记物；所述示踪标记物优选包括荧光素；
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述空载的MHCI是多聚体；
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述紫外光的波长大于等于紫外光敏感的多肽的断裂阈值；
6.根据权利要求1～5任一项所述的制备方法，其特征在于，MHC单体含有可生物素化序列；
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
8.权利要求1～7任一项所述的制备方法制备得到的空载的MHCI。
9.权利要求1～7任一项所述的空载的MHCI的制备方法，或权
10.非诊断和治疗目的的细胞检测方法，其特征在于，包括将权利要求8所述的空载的MHCI与抗原肽混合孵育，然后与待测样本混合；所述空载的MHCI连接有示踪标记物；
...【技术特征摘要】
1.一种空载的mhci的制备方法，其特征在于，将分离的mhc分子α链，分离的mhc分子β2m链和紫外光敏感的多肽混合并复性，得到肽-mhc，然后经紫外光照射使紫外光敏感的多肽断裂从肽-mhc中解离，获得空载的mhci。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，mhc分子α链和/或mhc分子β2m还包括至少一个氨基酸的突变；
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述空载的mhci连接有示踪标记物；所述示踪标记物优选包括荧光素；
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述空载的mhci是多聚体；
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征...
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