【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种细胞蛋白提取方法，具体涉及一种快速定量提取贴壁细胞蛋白的方法及应用。
技术介绍
1、在进行医学实验的过程中，体外试验往往需要对细胞进行各种物理或化学刺激，随后提取细胞中的蛋白，通过western blot进行半定量检测，从而对表形和机制进行探究。以往的常用的提取贴壁细胞蛋白的方法如下(参考：李燕《精编分子生物学实验技术(研究生本科生教学用书)》世界图书出版2017年9月(第一版)：110-113)：
2、①以6孔板为例，使用pbs洗涤细胞2次，吸干孔板内的液体；
3、②每个孔加入100μl裂解液(含pmsf)，使用细胞刮刮取孔板底部，于冰上静置30min。
4、③裂解结束后收集孔板内的液体，于1.5ml ep管中，4℃12000r/min离心5min,取上清分装于0.5ml离心管。
5、④在③得到的上清中加入1/4体积的5x loading buffer，100℃水浴/金属浴煮10min。
6、⑤提取好的蛋白置于-20℃保存。
7、由上可知，这种传统的方法需要的时间长，常常在1小时左右，步骤繁琐，且提取的蛋白浓度难以控制，常常需要后续通过bca法调整蛋白浓度，才能用于western blot检测。
8、因此，为方便实验的进行、缩短实验流程和时间，提高实验效率，需要对现有的提取方法进行改进。
技术实现思路
1、本专利技术的目的就是为了解决上述问题至少其一而提供一种快速定量提取贴壁细胞
2、本专利技术的目的通过以下技术方案实现：
3、本专利技术第一方面公开了一种快速定量提取贴壁细胞蛋白的方法，包括如下步骤：
4、s1：在细胞培养板的孔中，洗涤细胞若干次，随后吸干细胞培养板上的液体；
5、s2：配置裂解液与loading buffer的混合液，并向步骤s1处理后的细胞培养板的孔中加入100μl的混合液，随后于冰上静置；
6、s3：将步骤s2处理后的细胞培养板的孔中液体转移至ep管内，随后在恒温浴下加热，完成贴壁细胞蛋白的提取。
7、优选地，步骤s1中，采用pbs缓冲液洗涤细胞。
8、优选地，步骤s2中，所述的混合液包括如下体积百分数的组分：
9、
10、优选地，蛋白酶抑制剂包括pmsf。
11、优选地，步骤s2中，在加入混合液后，使用移液枪枪头的底部刮取孔板底部，以充分混匀避免沉淀或分层。
12、优选地，步骤s2中，在冰上静置1-2min。
13、优选地，步骤s3中，转移采用移液枪进行。
14、优选地，步骤s3中，所述的恒温浴为水浴或金属浴。
15、优选地，步骤s3中，所述的恒温浴为：在100℃下煮10min。
16、本专利技术第二方面公开了一种如上任一所述的快速定量提取贴壁细胞蛋白的方法在western blot检测中的应用。
17、本专利技术的工作原理：
18、本方案的关键在于通过细胞的密度判断提取蛋白的浓度。由于培养孔板的大小是固定的，当每个孔板的细胞密度长到大致相同的程度时，意味着此时使用相同体积的裂解液提取蛋白，所能得到的蛋白液浓度也是大致相同的。这是一种半定量的方法，考虑到western blot本身也是一种半定量的实验方法，通过本方法提取的蛋白不仅效率高、易于控制，还可以基本满足western blot的实验需求。
19、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
20、本专利技术提出的提取方法使得提取蛋白时间大幅缩短，且省去了繁琐的离心步骤，通常在30min内就可以完成。这是由于裂解液和loading buffer一起加入后产生的沉淀并不明显，可以省去离心步骤。当控制细胞培养板孔内的细胞量基本相同时，所提取的蛋白浓度也基本相同，可以直接用于western blot检测。
21、因此，一种快速提取贴壁细胞蛋白的方法，能够大幅缩短提取蛋白的时间，且蛋白浓度基本保持一致，提取出的蛋白通常可以直接用于western blot检测。
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1.一种快速定量提取贴壁细胞蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种快速定量提取贴壁细胞蛋白的方法，其特征在于，步骤S1中，采用PBS缓冲液洗涤细胞。
3.根据权利要求1所述的一种快速定量提取贴壁细胞蛋白的方法，其特征在于，步骤S2中，所述的混合液包括如下体积百分数的组分：
4.根据权利要求3所述的一种快速定量提取贴壁细胞蛋白的方法，其特征在于，蛋白酶抑制剂包括PMSF。
5.根据权利要求1所述的一种快速定量提取贴壁细胞蛋白的方法，其特征在于，步骤S2中，在加入混合液后，使用移液枪枪头的底部刮取孔板底部。
6.根据权利要求1所述的一种快速定量提取贴壁细胞蛋白的方法，其特征在于，步骤S2中，在冰上静置1-2min。
7.根据权利要求1所述的一种快速定量提取贴壁细胞蛋白的方法，其特征在于，步骤S3中，转移采用移液枪进行。
8.根据权利要求1所述的一种快速定量提取贴壁细胞蛋白的方法，其特征在于，步骤S3中，所述的恒温浴为水浴或金属浴。
9.根据权利要求1所述的一种
10.一种如权利要求1-9任一所述的快速定量提取贴壁细胞蛋白的方法在WesternBlot检测中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种快速定量提取贴壁细胞蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种快速定量提取贴壁细胞蛋白的方法，其特征在于，步骤s1中，采用pbs缓冲液洗涤细胞。
3.根据权利要求1所述的一种快速定量提取贴壁细胞蛋白的方法，其特征在于，步骤s2中，所述的混合液包括如下体积百分数的组分：
4.根据权利要求3所述的一种快速定量提取贴壁细胞蛋白的方法，其特征在于，蛋白酶抑制剂包括pmsf。
5.根据权利要求1所述的一种快速定量提取贴壁细胞蛋白的方法，其特征在于，步骤s2中，在加入混合液后，使用移液枪枪头的底部刮取孔板底部。
6.根...
【专利技术属性】
技术研发人员：王誉霖，沈子妍，章晓燕，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：
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