本发明专利技术公开了一种用于检测鸡传染性支气管炎的试剂盒的抗原及其制备方法、试剂盒，涉及生物工程技术领域。本发明专利技术利用能够稳定表达重组鸡传染性支气管炎病毒核蛋白(N蛋白)的重组菌，在特定条件下诱导表达重组N蛋白并经亲和层析纯化。用纯化出的重组蛋白作为包被抗原，建立了一种简便、特异的间接ELISA方法。本发明专利技术还为检测鸡传染性支气管炎病毒抗体提供了特异、敏感、快速、操作简便的试剂盒。
1、传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,ibv)属于冠状病毒科、冠状病毒属、γ冠状病毒属，可引起鸡传染性支气管炎(infectious bronchitis,ib)，表现为鸡呼吸道疾病、肾脏和生殖腺病变。该病给世界各地的养鸡业造成了严重的经济损失，目前主要依靠灭活疫苗和弱毒疫苗防控，但病毒易于突变、重组出现新的毒株而导致该病在鸡群时有发生。目前ibv的血清学诊断方法主要有鸡胚中和试验、琼脂扩散试验(agpt)、血凝抑制试验(hi)和酶联免疫吸附试验(elisa)。elisa相对于其他方法具有灵敏度高、简便快速、特异性强等优点，有利于检测大规模群体的免疫状况，成为在ibv检测中的首选方法。
1、本专利技术所要解决的技术问题在于，提供一种用于鸡传染性支气管炎检测试剂盒的抗原及其制备方法，其具有良好的免疫原性，表达效率高，纯度高，包被量小，反应灵敏，为试剂盒的制备奠定了良好基础。
>5、(1)采用如核苷酸序列如seq id no：1所示的上游引物和seq id no：2所示的下游引物扩增ibv n基因，得到ibv n基因片段；6、(2)将ibv n基因整合到质粒载体pet-28b中，得到重组质粒；
7、(3)将所述重组质粒转化大肠杆菌中，得到重组菌液；
8、(4)将重组菌液在异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷的诱导下表达重组蛋白，并纯化，即得。
9、作为上述技术方案的改进，步骤(1)中，采用核苷酸序列如seq id no：1所示的上游引物，核苷酸序列如seq id no：2所示的下游引物进行pcr扩增，得到ibv n基因片段；
10、其中，pcr反应体系包括：premix taqtm5μl；上游引物1μl；下游引物1μl；模板1μl；ddh2o 2μl；
11、pcr反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸2min；72℃保温5min。
12、作为上述技术方案的改进，步骤(2)中：
13、将pet-28b质粒通过bamhⅰ和notⅰ酶进行酶切；将酶切后的质粒、ibv n基因片段与同源重组酶在16℃反应，得到重组质粒；
14、其中，酶切反应体系包括：bamhⅰ1μl、notⅰ1μl、buffer 2μl、模板1μl、ddh2o 15μl，酶切反应条件为：37℃2h；
15、同源重组反应体系为2×ce mix 5μl，ibv n基因片段2μl，酶切后pet-28b质粒1μl，ddh2o 2μl。
16、作为上述技术方案的改进，步骤(4)中，采用his标签镍柱亲和层析柱纯化；采用洗涤液洗涤15～25次，洗脱液洗脱15～25次，其中，洗脱液为非变性洗脱液，其咪唑浓度为200～300mm；洗涤液为非变性洗涤液，其咪唑浓度为10～30mm。
17、相应的，本专利技术还公开了一种用于检测鸡传染性支气管炎的试剂盒的抗原，其由上述的用于检测鸡传染性支气管炎的试剂盒的抗原的制备方法制备而得。
18、相应的，本专利技术还公开了一种用于检测鸡传染性支气管炎的试剂盒，其包括上述的抗原。
19、作为上述技术方案的改进，还包括酶标板、hrp标记的羊抗鸡igg抗体、阳性血清、阴性血清、封闭液、洗涤液、样品稀释液、抗体稀释液、显色液和终止液。
20、其中，封闭液磷酸缓冲液(pbst)，其含有1wt％～5wt％的牛血清白蛋白(bsa)或1wt％～10wt％脱脂奶粉或含有酪蛋白；示例性的为含有2wt％bsa的pbst、含有3wt％bsa的pbst、含有4wt％bsa的pbst、含有2wt％脱脂奶粉的pbst、含有4wt％脱脂奶粉的pbst、含有6wt％脱脂奶粉的pbst或含有8wt％脱脂奶粉的pbst，但不限于此。优选的为含有2％ bsa的pbst，其ph为7.4。
21、所述样品稀释液为磷酸缓冲液(pbst)，其含有0.25wt％～0.5wt％的牛血清白蛋白(bsa)或含有0.8wt％～1.2wt％的牛血清白蛋白(bsa)与浓度为10wt％～20wt％的胎牛血清(fbs)；示例性的为含有0.3wt％bsa的pbst、含有0.4wt％bsa的pbst、含有0.45wt％bsa的pbst、含有1wt％bsa和12wt％fbs的pbst或含有1.1wt％和14wt％fbs的pbst，但不限于此。优选的为含有1wt％bsa和15wt％fbs的pbst。
22、所述抗体稀释液为磷酸缓冲液(pbst)，但不限于此。
23、所述洗涤液为包括0.01wt％～0.1wt％tween-20的pbs或pbst，示例性的为包括0.03wt％tween-20的pbs、包括0.05wt％tween-20的pbs或包括0.07wt％tween-20的pbs，但不限于此。优选的为含有0.05wt％tween-20的pbs，其ph为7.4。
24、所述终止液为浓度为1m～2m的硫酸溶液，优选的为浓度为2m的硫酸溶液。
25、其中，阳性血清为抗ibv鸡血清，阴性血清为spf鸡血清(specific pathogen free无特定病原)。
26、相应的，本专利技术还公开了一种鸡传染性支气管炎的检测方法，其包括：
27、(1)采用含有上述的抗原的包被液包被酶标板，其中，包被浓度为0.25μg/ml～0.5μg/ml，包被液为浓度为0.01m～0.1m的碳酸钠溶液；
28、(2)去除包被液后采用上述的洗涤液洗涤，并加入上述的封闭液封闭1h～3h；
29、(3)将待测样品采用上述的样品稀释液以1:125～1:2000的比例稀释孵育后加入酶标板，并采用上述的阳性血清、阴性血清设置阳性血清对照和阴性血清对照；其中，孵育温度为35℃～39℃，孵育时间为45min～120min
30、(4)将hrp标记的羊抗鸡igg抗体采用上述的抗体稀释液以1:5000～1:12500的比例稀释孵育后加入酶标板，其中，孵育温度为35℃～39℃，孵育时间为30min～90min；
31、(5)将上述的显色液加入酶标板，显色5min～15min后加入上述的终止液，测定；
32、若待测样品的od450nm值≥0.276，则判定为ibv阳性，反之则为阴性。
33、实施本专利技术，具本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测鸡传染性支气管炎的试剂盒的抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的用于检测鸡传染性支气管炎的试剂盒的抗原的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，采用核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物，核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示的下游引物进行PCR扩增，得到IBV N基因片段；
3.如权利要求1所述的的用于检测鸡传染性支气管炎的试剂盒的抗原的制备方法，其特征在于，步骤(2)中：
4.如权利要求1所述的用于检测鸡传染性支气管炎的试剂盒的抗原的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，采用HIS标签镍柱亲和层析柱纯化；采用洗涤液洗涤15～25次，洗脱液洗脱15～25次，其中，洗脱液为非变性洗脱液，其咪唑浓度为200～300mM；洗涤液为非变性洗涤液，其咪唑浓度为10～30mM。
5.一种用于检测鸡传染性支气管炎的试剂盒的抗原，其由如权利要求1～4任一项所述的用于检测鸡传染性支气管炎的试剂盒的抗原的制备方法制备而得。
6.一种用于检测鸡传染性支气管炎的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求5所述的抗原。
7.如权利要求6所述的用于检测鸡传染性支气管炎的试剂盒，其特征在于，还包括酶标板、HRP标记的羊抗鸡IgG抗体、阳性血清、阴性血清、封闭液、洗涤液、样品稀释液、抗体稀释液、显色液和终止液。
8.如权利要求7所述的用于检测鸡传染性支气管炎的试剂盒，其特征在于，所述封闭液为磷酸缓冲液，其含有1wt％～5wt％的牛血清白蛋白或1wt％～10wt％的脱脂奶粉；
9.如权利要求6所述的用于检测鸡传染性支气管炎的试剂盒，其特征在于，所述封闭液为磷酸缓冲液，其含有2wt％的牛血清白蛋白；
10.一种鸡传染性支气管炎的检测方法，其特征在于，包括：
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【技术特征摘要】
1.一种用于检测鸡传染性支气管炎的试剂盒的抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的用于检测鸡传染性支气管炎的试剂盒的抗原的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，采用核苷酸序列如seq id no：1所示的上游引物，核苷酸序列如seq idno：2所示的下游引物进行pcr扩增，得到ibv n基因片段；
3.如权利要求1所述的的用于检测鸡传染性支气管炎的试剂盒的抗原的制备方法，其特征在于，步骤(2)中：
4.如权利要求1所述的用于检测鸡传染性支气管炎的试剂盒的抗原的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，采用his标签镍柱亲和层析柱纯化；采用洗涤液洗涤15～25次，洗脱液洗脱15～25次，其中，洗脱液为非变性洗脱液，其咪唑浓度为200～300mm；洗涤液为非变性洗涤液，其咪唑浓度为10～30mm。
5.一种用于检测鸡传染性...
【专利技术属性】
技术研发人员：巫静，何献铭，陈瑞爱，熊挺，刘晓，谢紫葳，吕亚迪，李桂敏，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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