【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程与酶工程，具体涉及一种蛋白酶k突变体及其制备方法。
技术介绍
1、蛋白酶k(ec 3.4.21.64)，是一种来自于林伯氏白色念球菌(tritirachium albumlimber)的丝氨酸蛋白酶，具有典型的催化三联体结构asp39-his69-ser224，是已知的内肽酶中最有活性的之一，能非特异性水解天然的和变性的蛋白质，能优先分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸c末端邻接的酯键和肽键。成熟蛋白酶由279个氨基酸组成，两个二硫桥和两个键合的钙离子使得紧密结构稳定。一般条件下，蛋白酶k使用的ph范围是7-10.0之间，在20-60℃之间蛋白酶k的活性都可以达到80％以上。在科研方面，该酶被广泛应用于核酸的提取过程，是重要的工具酶。随着核酸检测技术的发展，蛋白酶k作为降解蛋白质，提取rt-qpcr模板的重要酶类，市场需求量激增。同时该酶对sds、尿素等具有良好的抗性，因此在洗涤业、饲料行业，以及污水处理、造纸、食品等领域均展现出良好的应用效果。
2、早期商业化供应的蛋白酶k主要由林伯氏白色念球菌获得。林伯氏白色念球菌生长缓慢，难以高密度培养，蛋白酶k的产量较低，林伯氏白色念球菌还会分泌其他的蛋白酶，增加了下游分离纯化的难度。后来罗氏诊断等公司(us7368274b2，wo2002072634a2)利用毕赤酵母表达体系实现了蛋白酶k的分泌表达，降低了纯化成本，提高了蛋白酶k的产量。但是该酶与国外商品化蛋白酶相比，活性还有一定差距。因此如何对蛋白酶k进行改造，以提高其表达水平和酶活性具有重
技术实现思路
1、针对当前产业需求和现有技术不足，本专利技术目的在于提供一种酶活力提高的蛋白酶k突变体及其制备方法。本专利技术主要通过易错pcr构建蛋白酶k突变库，筛选获得了蛋白酶k酶活力提高的突变体。
2、为了实现上述目的，本专利技术采取如下的技术方案：
3、本专利技术提供一种蛋白酶k突变体，所述蛋白酶k突变体的氨基酸序列是在亲本蛋白酶k氨基酸序列的基础上第244位的甲硫氨酸(met)替换为苯丙氨酸(phe)，所述亲本蛋白酶k氨基酸序列如seq id no：1、2或3所示。
4、根据本专利技术一种实施方式，所述蛋白酶k突变体的氨基酸序列如seq id no：4所示。
5、本专利技术还提供上述蛋白酶k突变体的编码基因。
6、本专利技术还提供包含上述编码基因的载体、重组载体或表达载体。
7、本专利技术还提供包含上述编码基因或重组载体的宿主细胞。
8、本专利技术还提供上述蛋白酶k突变体的应用，其用于酶解蛋白质，优选的，用于分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸c末端邻接的酯键和/或肽键。
9、本专利技术还提供制备上述蛋白酶k突变体的方法，该方法通过利用本专利技术所述蛋白酶k突变体的编码基因或包含编码基因的表达载体进行基因重组和表达。
10、本专利技术还提供一种酶解蛋白质的方法，该方法包括使蛋白质与本专利技术所述蛋白酶k突变体接触的步骤，在能够通过所述蛋白酶k突变体催化酶解蛋白质的条件下进行。
11、本专利技术还提供一种提高蛋白酶k酶活力的方法，该方法是通过在亲本蛋白酶k中引入m244f取代，所述亲本蛋白酶k具有如seq id no：1、2或3所示的氨基酸序列。
12、本专利技术有益效果：
13、本专利技术利用易错pcr技术，在体外对林伯氏白色念球菌来源蛋白酶k进行定向进化，获得酶活力提高的蛋白酶k突变体m244f及其重组菌株tccc 31261，适宜条件下，本专利技术蛋白酶k突变体发酵液酶活力高达4325.54±51.76u/ml，与其亲本(3276.24u/ml)对比酶活力提高了32.03％左右。
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1.一种蛋白酶K突变体，其特征在于，所述蛋白酶K突变体的氨基酸序列是在亲本蛋白酶K氨基酸序列的基础上第244位的甲硫氨酸替换为苯丙氨酸，所述亲本蛋白酶K氨基酸序列如SEQ ID NO：1、2或3所示。
2.根据权利要求1所述蛋白酶K突变体，其特征在于，所述蛋白酶K突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
3.权利要求1或2所述蛋白酶K突变体的编码基因。
4.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求3所述编码基因。
5.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求3所述编码基因或权利要求4所述重组载体。
6.如权利要求5所述宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是毕赤酵母细胞。
7.权利要求1或2所述蛋白酶K突变体用于酶解蛋白质的应用，优选的，用于分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C末端邻接的酯键和/或肽键。
8.一种制备权利要求1或2所述蛋白酶K突变体的方法，其特征在于，该方法包括：在适宜条件下培养权利要求5所述宿主细胞并使其表达权利要求3所述编码基因，然后从其培养物或表达产物中分离得到蛋白
9.一种酶解蛋白质的方法，其特征在于，该方法包括使蛋白质与权利要求1或2所述蛋白酶K突变体接触的步骤，在能够通过所述蛋白酶K突变体催化酶解蛋白质的条件下进行。
10.一种提高蛋白酶K酶活力的方法，其特征在于，该方法是通过在亲本蛋白酶K中引入M244F取代，所述亲本蛋白酶K具有如SEQ ID NO：1、2或3所示的氨基酸序列。
...【技术特征摘要】
1.一种蛋白酶k突变体，其特征在于，所述蛋白酶k突变体的氨基酸序列是在亲本蛋白酶k氨基酸序列的基础上第244位的甲硫氨酸替换为苯丙氨酸，所述亲本蛋白酶k氨基酸序列如seq id no：1、2或3所示。
2.根据权利要求1所述蛋白酶k突变体，其特征在于，所述蛋白酶k突变体的氨基酸序列如seq id no：4所示。
3.权利要求1或2所述蛋白酶k突变体的编码基因。
4.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求3所述编码基因。
5.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求3所述编码基因或权利要求4所述重组载体。
6.如权利要求5所述宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是毕赤酵母细胞。
7.权利要求1或2所述蛋白酶...
【专利技术属性】
技术研发人员：李玉，路福平，蔡逸安，史超硕，李庆刚，刘逸寒，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：
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