【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种重组卡介苗及其构建与应用，属于生物医药和卫生领域。
技术介绍
1、结核病(tuberculosis，tb)是由单一病原菌结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis，mtb)感染引起的死亡率最高的传染病。在结核病预防方面，20世纪20年代首次使用的卡介苗(bcg)仍然是唯一获准用于结核预防的疫苗，距今已经使用百年的时间。尽管bcg接种作为儿童免疫规划的一部分在全球接种覆盖率很高，但卡介苗的保护率有限(约0-80％)，而且免疫保护效力随时间减弱，且成人接种后无保护作用。再加之全球结核病发病率下降缓慢等现实，提示需要一种更加有效的结核疫苗。此外，bcg只能起到预防结核病的作用，而对于已经感染mtb人群不具有治疗作用。另外，除了活动性结核患者以外，大部分人群属于结核潜伏感染者(即虽感染了mtb但并未表现明显症状)。据估算，结核潜伏感染人群全球约有20亿，他们急需治疗性药物进行根治或减缓发病。近年，智飞生物开发获批的注射用母牛分枝杆菌(商品名：微卡)除了用于辅助治疗结核病，还可用于预防结核潜伏感染人群进展为结核病，因此具有广泛的临床应用价值。
2、我们前期基础研究成果提示，bcg表达的rv0410c蛋白对宿主固有免疫信号通路和自噬/吞噬流均具有显著抑制作用。因此，敲除rv0410c基因后不但有利于解除宿主的免疫信号通路抑制，还有利于打通宿主自噬/吞噬流(通畅的自噬流将进一步有利于抑制宿主过度炎症反应维持免疫平衡并促进抗原提呈)，最终提升机体的抗感染免疫水平。综上，与传统的卡介苗相比，敲除
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是提供一种重组卡介苗(bcg)及其构建和应用，是在野生型bcg基础上敲除抑制固有免疫nf-κb信号通路和自噬/吞噬流的基因rv0410c。
2、本专利技术的第一个目的是提供一种重组卡介苗，以减毒牛型结核杆菌bcg为目的菌，敲除基因组上的rv0410c基因。具体地，其核苷酸序列如seq id no：1所示。
3、本专利技术的第二个目的是提供构建所述重组卡介苗的方法，所述方法为将减毒牛型结核杆菌bcg基因组上rv0410c基因进行敲除，所述rv0410c基因的核苷酸序列如seq idno：1所示。
4、在一种实施方式中，所述方法为通过温敏型噬菌体转导介导的同源重组方式将包含rv0410c基因上下游同源臂的同源交换底物转导进卡介苗基因组中进行rv0410c基因的敲除。
5、在一种实施方式中，所述方法包含以下步骤：
6、(1)以bcg全基因组dna为模板，分别设计两对针对rv0410c基因的左、右臂引物，扩增rv0410c基因的左、右臂连接到p0004s质粒(p0004s-δrv0410c重组质粒)，并酶切验证。
7、(2)分别酶切p0004s-δrv0410c质粒和phae159质粒，连接酶切后的片段，获得phae159-δrv0410c噬菌体包装质粒，并进行酶切验证。
8、(3)将phae159-δrv0410c质粒电转入耻垢分枝杆菌mc2155感受态细胞，包装rv0410c敲除噬菌体。挑取噬菌斑，进行扩大培养，并计算噬菌体滴度。
9、(4)制备bcg侵染感受态，以细菌：噬菌体＝1:10的比例混匀，避光孵育4小时，补加10ml 7h9培养基，37℃孵育20小时，离心并涂布于含75μg/ml潮霉素的7h10平板上，37℃培养4-6周，挑取阳性克隆。
10、(5)挑取单克隆菌落置于7h9培养基中，静置培养3周，抽提菌株全基因组dna，以rv0410c基因的左、右臂远端序列设计引物进行pcr验证。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的条带并进行测序验证。同时收集处于对数期的野生株和敲除株菌液，超声破碎，提取蛋白，蛋白免疫印迹实验检测rv0410c蛋白的表达情况。
11、按照本专利技术的另一个方面，提供了一种所述的重组卡介苗在制备用于防治结核病的疫苗或药物中的应用。
12、本专利技术还提供一种用于结核病防治的疫苗或药物，其包括所述重组卡介苗，以及药学上可接受的载体或助剂。具体地，其以注射制剂，具体是适合于皮内、黏膜给药的剂型。
13、本专利技术提供的重组卡介苗可有效提升宿主的固有免疫应答反应，降低病原菌在宿主细胞和小鼠体内的存活能力，在治疗结核病、预防结核感染进展发病以及预防mtb感染等方面均显著优于传统bcg。
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1.一种重组卡介苗，其特征在于，以减毒牛型结核杆菌BCG为出发菌，敲除基因组上的Rv0410c基因。
2.如权利要求1所述的重组卡介苗，其特征在于，所述Rv0410c基因的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。
3.构建权利要求1或2所述重组卡介苗的方法，其特征在于，将减毒牛型结核杆菌BCG基因组上的Rv0410c基因进行敲除，所述Rv0410c基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，通过温敏型噬菌体转导介导的同源重组方式将包含Rv0410c基因左、右臂的质粒转导进卡介苗基因组中进行Rv0410c基因敲除。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：制备针对Rv0410c基因敲除的噬菌体包装质粒，转染耻垢分枝杆菌包装敲除噬菌粒，将其用于侵染BCG感受态细菌，得到敲除基因组上的Rv0410c基因的BCG，即为重组卡介苗。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：
8.如权利要求1或2所述重组卡介苗在制备用于结核病防治的疫苗或药物中的应用。
9.一种用于结核病防治的疫苗或药物，其包括如权利要求1或2所述重组卡介苗，以及药学上可接受的载体或助剂。
10.如权利要求9所述的疫苗或药物，其特征在于，其以注射制剂，具体是适合于皮内、黏膜给药的剂型。
...【技术特征摘要】
1.一种重组卡介苗，其特征在于，以减毒牛型结核杆菌bcg为出发菌，敲除基因组上的rv0410c基因。
2.如权利要求1所述的重组卡介苗，其特征在于，所述rv0410c基因的核苷酸序列如seqid no：1所示。
3.构建权利要求1或2所述重组卡介苗的方法，其特征在于，将减毒牛型结核杆菌bcg基因组上的rv0410c基因进行敲除，所述rv0410c基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，通过温敏型噬菌体转导介导的同源重组方式将包含rv0410c基因左、右臂的质粒转导进卡介苗基因组中进行rv0410c基因敲除。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：制备针对...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘翠华，汪静，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：
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