一种基于多重恒温扩增的实时荧光检测方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种基于多重恒温扩增的实时荧光检测方法及其应用。将目标基因与内参基因的恒温扩增引物置于一个恒温扩增体系中进行反应，恒温扩增体系包括引物混合液、反应液和DNA聚合酶；引物混合液中包括分别扩增目标基因和内参基因的上游引物、下游外引物、内侧上游IPF引物、内侧下游IPR引物和引物LF；扩增目标基因的引物组合中任一引物和内参基因的引物组合中任一引物的富含鸟嘌呤、腺嘌呤或胸腺嘧啶的区域上标记有荧光基团，所述荧光基团具体标记在离5’或3’末端3‑5个碱基的腺嘌呤或胸腺嘧啶碱基上。所述方法可实现单管的多重检测，具备防止PCR产物污染的功能，具有检测时间短、灵敏度高、方便快捷的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于核酸检测，具体涉及一种基于多重恒温扩增的实时荧光检测方法及其应用。

技术介绍

1、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，简称pcr)是一种目前常用的核酸扩增技术，是分子诊断中的基本技术。此类反应的技术特点是基于dna聚合酶和引物的高温变性-低温退火-中温延伸特点而进行的。由于此类反应需要复杂而频繁的升降温过程，造成其设备的温控单元过于复杂和昂贵的同时，极大地延长了完成反应所需要的时间，从而增加核酸检测的时间和成本。

2、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，lamp)是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换dna聚合酶(bst dna polymerase)的作用下，60-65℃恒温扩增，15-60分钟左右即可实现109-1010倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。

3、在核酸检测中目前多用的自淬灭探针技术为双淬灭探针，依赖于dna聚合酶的核酸外切酶活性降解探针，从而使得双淬本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种基于多重恒温扩增的实时荧光检测方法，其特征在于，将目标基因与内参基因的恒温扩增引物置于一个恒温扩增体系中进行反应，所述恒温扩增体系包括引物混合液、反应液和DNA聚合酶；

2.根据权利要求1所述的基于多重恒温扩增的实时荧光检测方法，其特征在于，所述引物混合液中还包括引物LR；

3.根据权利要求1或2所述的基于多重恒温扩增的实时荧光检测方法，其特征在于，所述DNA聚合酶为具有链置换能力的DNA聚合酶，所述DNA聚合酶包括Bst系列DNA聚合酶；

4.根据权利要求3所述的基于多重恒温扩增的实时荧光检测方法，其特征在于，在恒温扩增体系中DNA聚合酶的终...

【技术特征摘要】

1.一种基于多重恒温扩增的实时荧光检测方法，其特征在于，将目标基因与内参基因的恒温扩增引物置于一个恒温扩增体系中进行反应，所述恒温扩增体系包括引物混合液、反应液和dna聚合酶；

2.根据权利要求1所述的基于多重恒温扩增的实时荧光检测方法，其特征在于，所述引物混合液中还包括引物lr；

3.根据权利要求1或2所述的基于多重恒温扩增的实时荧光检测方法，其特征在于，所述dna聚合酶为具有链置换能力的dna聚合酶，所述dna聚合酶包括bst系列dna聚合酶；

4.根据权利要求3所述的基于多重恒温扩增的实时荧光检测方法，其特征在于，在恒温扩增体系中dna聚合酶的终浓度为0.1-2u/μl；

5.根据权利要求1-4中任一项所述的基于多重恒温扩增的实时荧光检测方法，其特征在于，所述恒温扩增的反应程序为55-65℃，恒温扩增10-30min。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的基于多重恒温扩增的实时荧光检测方法，其特征在于，所述实时荧光检测方法检测的病原体包括新型冠状病毒、人乳头瘤病毒16型、人乳头瘤病毒18型、猫杯状病毒或猫疱疹病毒。

7.根据权利要求6所述的基于多重恒温扩增的实时荧光检测方法，其特征在于，检测的病原体为新型冠状病毒时，检测的目标基因为orf1ab基因、n基因，内参基因为rnase p基因；

8.根据权利要求6或7所述的基于多重恒温扩增的实时荧光检测方法，其特征在于，扩增orf1ab基因的上游外部引物为seq id no:1，下游外部引物为seq id no:2；内侧上游ipf引物为seq id no:3，内侧下游ipr引物为seq id no:4；引物lf为seq id no:5；

9.根据权利要求6所述的基于多重恒温扩增的实时荧光检测方法，其特征在于，检测的病原体为人乳头瘤病毒16型和人乳头瘤病毒18型时，检测的目标基因分别为hpv...

【专利技术属性】
技术研发人员：请求不公布姓名，
申请(专利权)人：丰疆智能深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：