【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域，特别涉及一种基于2-δδct法检测smn1基因拷贝数的试剂盒。
技术介绍
1、脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy，sma）是一种常染色体隐性遗传病，为婴幼儿期最常见致死性和致严重残疾的神经肌肉病之一。活婴发病率为1/5000～1/10000，正常人群致病基因携带率为1/35～1/50。临床上根据sma发病年龄和病程的不同，将患者分为i型、ii型、ⅲ型及ⅳ型，其中占患者比例约70％的i型临床表型最为严重，常于6个月内起病，多数于2岁内夭折。运动神经元存活基因smn1是sma的致病基因，smn2是smn1修饰基因，两者之间高度同源，仅存在5个碱基的差异。smn1突变可导致sma表型，突变的主要形式是smn1第7外显子缺失，而smn2拷贝数数量则和sma的严重程度有关。sma作为单基因遗传病，可防、可控，如夫妻双方均为携带者，smn1的拷贝数为1，不会有症状，但有25%的可能会生出sma患儿。所以针对孕前或孕早期人群甚至新生儿中，通过检测smn1外显子7的拷贝数，可以实现sma基因筛查三级防控，达到优生优育的重要手段。
2、常用的smn1基因拷贝数检测的技术包括：多重连接探针扩增（mlpa）、pcr-变性高效液相色谱（pcr-dhplc）、微滴式数字pcr（ddpcr）、荧光定量pcr等技术。mlpa检测通过靶向sma基因关键区域的特异性探针与smn1和smn2基因杂交后进行扩增，根据扩增产物和参照序列的比值，评价smn1/2的拷贝数。但mlpa由于操作复杂，杂交、
3、荧光定量pcr检测smn1拷贝数的方法则以管家基因为内参基因序列，采用taqman探针法或熔解曲线，分别对smn1第7外显子拷贝数和内参基因进行相对定量来判断是否发生缺失变异。2-δδct探针法荧光定量pcr，操作简便、成本低廉，适用于人群规模的筛查，有效避免了mlpa、pcr-dhplc和ddpcr的技术缺陷。但这这种相对定量方法的前提是：smn1和内参基因的扩增效率都应接近100%，相对偏差不超过5%，而样本的扩增效率受模板纯度和模板量的影响，故样本需要提取、纯化核酸，并要对核酸模板进行定量，只有模板量在一定范围才能分析相对拷贝数，为保证结果的准确，对样本的上样量有严格的要求。同时，需要引入独立的对照样本组，以2-δδct法pcr为基础的检测技术存在一个共同的缺陷就是待测样本和对照样本是分管检测，这样不可避免导致两者中目的基因和内参基因的扩增效率会有差异。所以，基于2-δδct法检测人运动神经元基因（smn1/2）拷贝数的专利，cn20150066921.2和cn201810353632.4，为减少对照样本的变异和保证结果的准确，均为对照样本设置3个不同浓度的复孔，取其ct均，以避免由于对照样本ct差异导致的检测结果的误差。
技术实现思路
1、为了克服上述问题，本专利技术提供基于2-δδct法检测smn1基因拷贝数的试剂盒，所述试剂盒包括作为内对照的线性化的质粒片段，所述线性化的质粒片段包括质粒载体骨架、设计的内参基因内对照序列和设计的smn1内对照序列；所述smn1内对照序列和人基因组中smn1待扩增片段的大小、位置和序列一致，仅在探针结合区与所述人基因组中smn1待扩增片段的核苷酸序列不同，以特异性区分样本中扩增的人基因组中smn1片段和扩增的smn1内对照序列；所述内参基因内对照序列和内参基因待扩增片段的大小、位置和序列一致，仅在探针结合区与所述内参基因待扩增片段的核苷酸序列不同，以特异性区分扩增的内参基因片段和扩增的内参基因内对照序列；所述smn1内对照序列和所述内参基因内对照序列通过一段含有限制性内切酶特异性识别位点的dna序列连接，经人工合成双链基因片段后，插入到质粒载体中，从而获得内对照质粒，在内参基因内对照序列、smn1内对照序列和所述质粒载体中均不含所述限制性内切酶特异性识别位点；所述内对照质粒经限制性内切酶酶切、纯化，得到所述线性化的质粒片段，所述线性化的质粒片段两端分别是所述smn1内对照序列和所述内参基因内对照序列，所述smn1内对照序列和所述内参基因内对照序列之间间隔2-10kb的质粒骨架序列。
2、在一种实施方式中，所述限制性内切酶特异性识别位点是apa i、sac ii、sma i或mlu i限制性内切酶特异性识别位点。
3、在一种实施方式中，所述限制性内切酶特异性识别位点是mlu i限制性内切酶特异性识别位点，所述质粒载体骨架为2.7kb的pucm-t载体。
4、在一种实施方式中，所述线性化的质粒片段中所述smn1内对照序列和所述内参基因内对照序列的数量是1:1、1:2或2:1。
5、在一种实施方式中，所述smn1内对照序列中探针结合区或所述内参基因内对照序列中探针结合区的长度为25-32bp碱基。
6、在一种实施方式中，所述smn1内对照序列是seq id no.1：5’- cccctacctccgcctcccaaagttgtgggattgtaggcatgagccactgcaagaaaaccttaactgcagcctaataattgttttctttgggataacttttaaagtacattaaaagactatcaacttaatttctgatcatattttgttgaataaaataagtaaaatgtcttgtgaaacaaaatgctttttaacatccatataaagctatctatatatagctatctatgtctatatagctattttttttaacttcctttattttccttctaaaacagactttgggacaaaaaagaaggaaggtgctcacattccttaaattaaggagtaagtctgccagcattatgaaagtgaatcttacttttgtaaaactttatggtttgtggaaaacaaatgtttttgaacatttaaaaagttcagatgttaaaaagttgaaaggttaatgtaaaac-3’。
7、在一种实施方式中，所述内参基因内对照序列是seq id no.2：5’-tcttgattcaactgtcacacacctgtcctta本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基于2-ΔΔCt法检测SMN1基因拷贝数的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括作为内对照的线性化的质粒片段，所述线性化的质粒片段包括质粒载体骨架、设计的内参基因内对照序列和设计的SMN1内对照序列；
2.根据权利要求1所述的的试剂盒，其特征在于，所述限制性内切酶特异性识别位点是Apa I、Sac II、Sma I或Mlu I限制性内切酶特异性识别位点。
3.根据权利要求2所述的的试剂盒，其特征在于，所述限制性内切酶特异性识别位点是Mlu I限制性内切酶特异性识别位点，所述质粒载体骨架为2.7kb的pUCm-T载体。
4.根据权利要求1所述的的试剂盒，其特征在于，所述线性化的质粒片段中所述SMN1内对照序列和所述内参基因内对照序列的数量是1:1、1:2或2:1。
5.根据权利要求1所述的的试剂盒，其特征在于，所述SMN1内对照序列中探针结合区或所述内参基因内对照序列中探针结合区的长度为25-32bp碱基。
6.根据权利要求1-5任一所述的的试剂盒，其特征在于，所述SMN1内对照序列是
7.根据权利要求1所述的
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述SMN2封闭探针与检测基因组中SMN1的荧光探针在同一条DNA链，其通过MGB修饰或LAN锁核酸修饰，提高Tm值，增加与拟封闭序列的结合特异性。
9.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述内参基因是RPP30，其中所述两对通用引物和五条探针如下：
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，检测基因组中SMN1的荧光探针和SMN2封闭探针通过MGB修饰。
...【技术特征摘要】
1.基于2-δδct法检测smn1基因拷贝数的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括作为内对照的线性化的质粒片段，所述线性化的质粒片段包括质粒载体骨架、设计的内参基因内对照序列和设计的smn1内对照序列；
2.根据权利要求1所述的的试剂盒，其特征在于，所述限制性内切酶特异性识别位点是apa i、sac ii、sma i或mlu i限制性内切酶特异性识别位点。
3.根据权利要求2所述的的试剂盒，其特征在于，所述限制性内切酶特异性识别位点是mlu i限制性内切酶特异性识别位点，所述质粒载体骨架为2.7kb的pucm-t载体。
4.根据权利要求1所述的的试剂盒，其特征在于，所述线性化的质粒片段中所述smn1内对照序列和所述内参基因内对照序列的数量是1:1、1:2或2:1。
5.根据权利要求1所述的的试剂盒，其特征在于，所述smn1内对照序列中探针结合区或所述内参基因内对照序列中探针结合区的...
【专利技术属性】
技术研发人员：钱俊杰，肖昊，高静，王思贤，
申请(专利权)人：北京华瀚基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。