【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测领域，特别涉及一种用于干血片样品的核酸释放剂及其方法。
技术介绍
1、干血斑(dried blood spot，dbs)，即将全血样品收集在滤纸上的血液采集方式，比传统的方法有一定的优势，它需求的血量较少，方便血样采集、存储运输，是基因检测尤其是大规模遗传病筛查过程中的一项有效工具。干血斑早在上世纪五六十年代就已被用于苯丙酮尿症的新生儿筛查。随着串联质谱技术等的发展，干血斑被广泛应用于各种新生儿遗传代谢病的“新筛”。近些年，干血斑在基因检测领域也得到长足的发展，耳聋、地中海贫血、新生儿重症联合免疫缺陷(scid)中的t细胞受体重组切除环dna(trecs)和kappa删除重组切除环(krecs)的筛查，使用的也是干血斑。
2、目前用于干血斑样本核酸提取方法主要有3种：(1)核酸释放方法：干血片经过清洗或不清洗，核酸释放剂浸润，高温裂解，离心得到核酸；(2)离心柱法：核酸裂解液裂解干血片中细胞，释放核酸后利用硅胶模特异性吸附核酸，再洗脱得到较纯的核酸；(3)磁珠法：核酸裂解液裂解干血片中的细胞，释放核酸后用磁珠吸附核酸，当条件改变时，磁珠释放吸附的核酸，从而洗脱得到较纯的核酸。目前来说，核酸释放方法相比来说操作简单，成本低廉，适合于高通量的筛查检测。
3、目前的干血斑核酸快速提取的技术比较少，且基本上都存在一定的局限性，同时适用范围有限。中国专利cn102866038a和cn105602942a提供的干血斑核酸提取方法中，干血斑处理包括振荡、热处理后需要过硅胶柱纯化，导致操作步骤和时间
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种可以进行高效核酸快速释放的试剂，所述试剂可以免去核酸的提取、纯化步骤，避免核酸丢失或污染，应用本专利技术的核酸释放剂和释放方法获得的核酸能够进行核酸的定量分析。本专利技术提供一种用于干血片样品的核酸释放剂，所述核酸释放剂包括热敏蛋白酶、强碱和tris缓冲液，其中所述热敏蛋白酶浓度为2.00～3.75u/ml，所述核酸释放剂的ph值为11～12，所述热敏蛋白酶在≥55℃时，加热5～10min能被完全灭活；所述热敏蛋白酶优选为热敏蛋白酶k。
2、在一种实施方式中，所述热敏蛋白酶k浓度为2.50～3.25u/ml。
3、在一种实施方式中，所述强碱为5～50mmol/l为naoh和/或koh。
4、在一种实施方式中，所述释放剂还包括bsa、非离子表面活性剂和edta，所述非表面活性剂优选为tween-20。
5、在一种实施方式中，所述释放剂包括2.50～3.25u/ml热敏蛋白酶k、5～30mmtris、20～40mm koh、50～500ng/μl bsa和0.05～0.5％体积百分比含量tween-20和0.5～5mm edta。
6、在一种实施方式中，所述释放剂包括2.50u/ml热敏蛋白酶k、10mm tris、20mmkoh、300ng/μl bsa和0.2％体积百分比含量tween-20和3mm edta。
7、在一种实施方式中，本专利技术提供一种干血片样品的核酸释放方法，所述方法包括以下步骤：
8、步骤1：打孔器打下的干血片，加入上述的核酸释放剂，涡旋振荡，瞬时离心；
9、步骤2：离心后的样本，30～40℃、5～20min后80～99℃、5～20min煮沸洗脱，离心收集上清。
10、在一种实施方式中，当所述干血片直径为3.2mm时，每片释放剂用量为30～100μl，进一步优选为40～50μl。
11、在一种实施方式中，所述涡旋振荡时间为3～10s。
12、在一种实施方式中，90～95℃、10～15min煮沸洗脱。
13、目前，尚未有适用于从干血片上直接进行核酸定量分析的核酸释放剂及释放方法的报导。但鉴于干血斑是均匀的，且打孔器打下的干血片大小一致，理论上可通过核酸直接释放后定量检测，不需要核酸提取、纯化和后续的核酸定量，但这一方法的前提是需要解决两个问题：一方面能够解决干血斑中免疫球蛋白、血红蛋白、脂类等dna聚合酶活性抑制问题，另一方面需要将干血片斑的细胞有效裂解，充分释放出核酸，尤其是对一些干燥过度的干血片，核酸的释放效率尤为关键。本专利技术从上述两个方向入手，探索合适的释放剂组份及相应的核酸释放方法，首先释放剂中的热敏蛋白酶组分能有效降解血液中的免疫球蛋白、血红蛋白等主要pcr抑制物，重要的是热敏蛋白酶在后续的高温裂解中又能完全灭活，降低这些物质对核酸定量的影响。其次，通过释放剂中的强碱、非离子去污剂和高温加热来提高干血片上细胞的裂解，增加核酸释放效率，热敏蛋白酶结合煮沸碱裂解可以解决某些过度干燥而导致的洗脱不全这一常见的问题。通过上述方法获得的干血斑核酸模板，直接用于干血斑中核酸的荧光定量pcr的定量检测，提高检测结果的准确性和灵敏度，操作简便快捷，适合高通量基因筛查，尤其是核酸定量检测。
14、本专利技术的核酸释放剂中含有的热敏蛋白酶k有效降解干血斑中的免疫球蛋白、血红蛋白等pcr抑制物，提高pcr扩增效率，处理后的热敏蛋白酶在后续样本高温裂解过程中又能被完全灭活，从而不影响后续的pcr扩增。
15、本专利技术的核酸释放剂采用强烈的蛋白变性剂，能够快速破解细胞中的蛋白结构，高效释放出核酸，增加干血斑的洗脱效率，同时释放剂中的热敏蛋白k和加热处理，又可以完全抑制dnase和rnase活性，使干血斑的核酸释放完全。
16、本专利技术中含有的tween-20属于表面活性剂，具有极性和非极性基团，能增加热敏蛋白酶的活性；含有的bsa是一种很好的稳定剂，能保护热敏蛋白酶k和dna聚合酶活性；含有的edta属于金属螯合剂，能够保护dna模板。本专利技术的热敏蛋白酶k和bsa、tween-20和edta的配合使用，会提高蛋白酶k的活性，相对单独蛋白酶k和单独的其他组分，对减少pcr抑制或提高pcr扩增效率的效果更好。
17、本专利技术核酸释放剂和核酸释放方法适用于干血斑、edta抗凝全血、枸橼酸钠抗凝全血标本。
18、本专利技术能够实现干血斑中核酸的快速释放，直接应用于荧光定量pcr本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于干血片样品的核酸释放剂，其特征在于，所述核酸释放剂包括热敏蛋白酶、强碱和Tris缓冲液，其中所述热敏蛋白酶浓度为2.00～3.75U/mL，所述核酸释放剂的pH值为11～12，所述热敏蛋白酶在≥55℃时，加热5～10min能被完全灭活；所述热敏蛋白酶优选为热敏蛋白酶K。
2.根据权利要求1所述的核酸释放剂，其特征在于，所述热敏蛋白酶K浓度为2.50～3.25U/mL。
3.根据权利要求1所述的核酸释放剂，其特征在于，所述强碱为5～50mmol/L为NaOH和/或KOH。
4.根据权利要求1所述的核酸释放剂，其特征在于，所述释放剂还包括BSA、非离子表面活性剂和EDTA，所述非表面活性剂优选为TWEEN-20。
5.根据权利要求4所述的核酸释放剂，其特征在于，所述释放剂包括2.50～3.25U/mL热敏蛋白酶K、5～30mM Tris、20～40mM KOH、50～500ng/μLBSA和0.05～0.5％体积百分比含量TWEEN-20和0.5～5mM EDTA。
6.根据权利要求5所述的核酸释放剂，其特征在于，所
7.干血片样品的核酸释放方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的核酸释放方法，其特征在于，当所述干血片直径为3.2mm时，每片释放剂用量为30～100μL，进一步优选为40～50μL。
9.根据权利要求7所述的核酸释放方法，其特征在于，所述涡旋振荡时间为3～10s。
10.根据权利要求7所述的核酸释放方法，其特征在于，90～95℃、10～15min煮沸洗脱。
...【技术特征摘要】
1.用于干血片样品的核酸释放剂，其特征在于，所述核酸释放剂包括热敏蛋白酶、强碱和tris缓冲液，其中所述热敏蛋白酶浓度为2.00～3.75u/ml，所述核酸释放剂的ph值为11～12，所述热敏蛋白酶在≥55℃时，加热5～10min能被完全灭活；所述热敏蛋白酶优选为热敏蛋白酶k。
2.根据权利要求1所述的核酸释放剂，其特征在于，所述热敏蛋白酶k浓度为2.50～3.25u/ml。
3.根据权利要求1所述的核酸释放剂，其特征在于，所述强碱为5～50mmol/l为naoh和/或koh。
4.根据权利要求1所述的核酸释放剂，其特征在于，所述释放剂还包括bsa、非离子表面活性剂和edta，所述非表面活性剂优选为tween-20。
5.根据权利要求4所述的核酸释放剂，其特征在于，所述释放剂包括2.50～3.25u/ml热敏蛋白酶k、5～30mm tr...
【专利技术属性】
技术研发人员：钱俊杰，肖昊，高静，王莉，王思贤，
申请(专利权)人：北京华瀚基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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