【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物快速检测领域，具体涉及一种基于pcr和荧光內滤的致病菌快速检测技术。
技术介绍
1、大肠杆菌也叫做大肠埃希氏菌，属于革兰氏阴性短杆菌，在自然界存在广泛，动物和人类的胃肠道中均可发现正常菌群，但是某些大肠杆菌会通过转座子、质粒、噬菌体或者毒力岛获得毒力因子而使其致病。大肠杆菌可以经由水及食物传而感染人体，部分受感染的人可能会有肠出血及严重的并发症如溶血尿毒症，据报道，全球每年有3890溶血性尿毒症病例，死亡人数达230人。肠出血性大肠杆菌毒性很强，感染剂量很低，1-100cfu的暴露量足以导致感染。
2、传统的检测方法例如平板计数法耗时长，免疫学检测如酶联免疫吸附中单抗的制备难度较大。随着检测技术的发展，分子学诊断也越来越广泛，主要以聚合酶链式扩增反应为代表，现阶段pcr扩增的成本逐渐降低，且pcr扩增技术具有较高的特异性和灵敏度，但常见的凝胶电泳表征过程通常伴随着有致癌作用的核酸染料，实时荧光定量pcr可以对结果做到实时定量和可视化，但所需仪器昂贵，不同平台对阈值的标准不统一。因此需要开发出一种灵敏度高，特异性强且操作简单的快速检测方法，来弥补食源性致病菌检测的局限性。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是基于上转换材料和耐尔蓝a染料的荧光内滤作用来对大肠杆菌pcr特异性扩增产物进行快速检测，以解决上述技术存在的问题，通过构建上转换材料-dna-耐尔蓝a复合物检测体系，实现了快速检测食品中大肠杆菌的目的，且该方法检测时间和灵敏度均优于传统的凝胶电泳。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
3、本专利技术提供一种基于上转换材料和耐尔蓝a染料荧光內滤的大肠杆菌快速检测方法，包括以下步骤：
4、步骤1，提取大肠杆菌基因组：利用溶菌酶的作用裂解富集的大肠杆菌，将dna释放到溶液体系中，利用固相介质将dna吸附出来，洗涤去除杂质，改变溶液ph使得dna溶解到te缓冲液中。
5、步骤2，将步骤1得到的基因组作为模板dna进行pcr扩增：pcr扩增的反应体系各组分有taq酶、pcr缓冲液(含mg2+)、寡核苷酸、上下游引物、dna模板和双蒸水。pcr反应程序包括了预变性、循环(变性、复性、延伸)和彻底延伸。
6、步骤3，制备得到上转换荧光纳米材料：将六水氯化钇、六水氯化钆、六水氯化镱以及六水氯化铒四种材料和乙醇、油酸、1-十八烯进行混合，在氮气的保护下加热升温，随后冷却至室温；将氟化铵、氢氧化钠溶于甲醇中，并缓慢加入冷却体系中，分两阶段水浴加热。在氮气的保护下，再次对反应体系进行加热，冷却至室温后用乙醇和环己烷进行多次离心清洗，真空干燥后得到上转换纳米材料。
7、步骤4，水溶性修饰上转换纳米颗粒：将步骤3得到的上转换纳米材料溶于三氯甲烷和乙醇的混合溶液中，并和阿仑膦酸进行搅拌混合。用纯水和乙醇对材料进行多次清洗，最终分散在纯水中。
8、步骤5，构建pcr产物-耐尔蓝a-上转换材料检测体系：将pcr产物和耐尔蓝a混合，后添加上转换纳米材料，进行荧光信号强度测定，以大肠杆菌浓度为横坐标，荧光信号强度和纵坐标，构建标准曲线。
9、步骤6，验证检测体系特异性：选择不同的标准菌株重复本专利技术的检测过程，记录输出的荧光信号强度。
10、优选的是，步骤1中选用的溶菌酶浓度为20mg/ml，体积为180μl；蛋白酶k的体积为20μl，该阶段孵育温度为56℃，孵育时间为30min，选用的缓冲溶液ph为8.0。
11、优选的是，步骤2中所述的pcr反应体系为：1.25μl模板dna，3μl上下游引物(浓度为10μm)，25μl pcr预混液(包含高纯度taq dna聚合酶，dntps和mg2+等成分)，17.5μl双蒸水；所述的pcr反应程序为：95℃预变性3min，循环阶段步骤为：95℃变性15s，60℃复性15s，72℃延伸40s，进行34次循环，后72℃彻底延伸5min。通过该pcr扩增过程可以得到长度为372bp的核酸片段。
12、优选的是，步骤2中所述的上下游引物序列分别为：
13、5’-aactcccgcagatacagaac-3’；
14、5’-ggaaacagtgacgcacatac-3’
15、优选的是，步骤3中所述的六水氯化钇、六水氯化钆、六水氯化镱以及六水氯化铒质量比为0.3492g∶0.2676g∶0.1860g∶0.0180g，乙醇∶油酸∶十八烯＝1ml∶3ml∶7ml；所述的第一次加热温度为150-170℃，加热温度为30min；所述的氟化铵和氢氧化钠的质量比为：0.1472g∶0.1g；所述的两阶段水浴条件为：50℃搅拌水浴40min，70℃搅拌水浴30min；所述的第二次升温温度为300℃，升温时间为1min。
16、优选的是，步骤4中所述的阿仑膦酸质量为50mg，上转换材料∶三氯甲烷∶乙醇＝200mg∶10ml∶4ml。
17、优选的是，步骤5中所述的耐尔蓝a浓度为0.7mg/ml，上转换材料浓度为0.1mg/ml；所述的pcr产物∶耐尔蓝a∶上转换材料＝50μl∶50μl∶16μl。
18、本专利技术公开了以下技术效果∶
19、(1)本专利技术公开了一种食品中大肠杆菌的荧光信号检测方法，基于上转换纳米颗粒和耐尔蓝a的荧光内滤原理，构建稳态特异性大肠杆菌检测体系，其检测原理图如图1所示；
20、(2)本专利技术构建的特异性检测体系，表现出了对大肠杆菌高度的选择性，能够消除其他菌的干扰，能够实现对食品中大肠杆菌含量的高灵敏度检测，克服了传统检测方法的不足，对食品安全的保障具有重要意义。
21、(3)本专利技术建立的大肠杆菌浓度与荧光信号强度的线性范围浓度为86-8.6×106cfu/ml，具有较宽的线性检测范围，检测限lod为39cfu/ml，灵敏度远高于凝胶电泳，可以很好的满足食品中大肠杆菌的高灵敏度检测，并具有较好的通用性。
22、(4)本专利技术通过构建特异性大肠杆菌检测体系，实现了食品中大肠杆菌的高特异性，灵敏度检测，具有较宽的检测线性范围和较低的检测限，从而使得该方法具有良好的实用前景。
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1.一种基于PCR和上转换材料荧光内滤的大肠杆菌快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于PCR和上转换材料荧光内滤的大肠杆菌快速检测方法，其特征在于，步骤2中，所述的PCR扩增反应体系为：1.25μL模板DNA，3μL上下游引物(浓度为10μM)，25μL PCR预混液(包含高纯度Taq DNA聚合酶，dNTPs，Mg2+，反应缓冲液和稳定剂等成分，17.5μL双蒸水。
3.根据权利要求1所述的基于PCR和上转换材料荧光内滤的大肠杆菌快速检测方法，其特征在于，步骤2中，所述的PCR扩增反应程序为：95℃预变性3min，循环阶段步骤为：95℃变性15s，60℃复性15s，72℃延伸40s，进行34次循环，后72℃彻底延伸5min。通过该PCR扩增过程可以得到长度为372bp的核酸片段。
4.根据权利要求1所述的基于PCR和上转换材料荧光内滤的大肠杆菌快速检测方法，其特征在于，步骤3中，所述的六水氯化钇、六水氯化钆、六水氯化镱以及六水氯化铒质量比为0.3492g∶0.2676g∶0.1860g∶0.0180g，乙醇∶油
5.根据权利要求1所述的基于PCR和上转换材料荧光内滤的大肠杆菌快速检测方法，其特征在于，步骤4中，所述的阿仑膦酸质量为50mg，上转换材料∶三氯甲烷∶乙醇＝200mg∶10mL∶4mL。
6.根据权利要求1所述的基于PCR和上转换材料荧光内滤的大肠杆菌快速检测方法，其特征在于，步骤5中，所述的耐尔蓝A浓度为0.7mg/mL，上转换材料浓度为0.1mg/mL；所述的PCR产物∶耐尔蓝A∶上转换材料＝50μl∶50μl∶16μl。
...【技术特征摘要】
1.一种基于pcr和上转换材料荧光内滤的大肠杆菌快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于pcr和上转换材料荧光内滤的大肠杆菌快速检测方法，其特征在于，步骤2中，所述的pcr扩增反应体系为：1.25μl模板dna，3μl上下游引物(浓度为10μm)，25μl pcr预混液(包含高纯度taq dna聚合酶，dntps，mg2+，反应缓冲液和稳定剂等成分，17.5μl双蒸水。
3.根据权利要求1所述的基于pcr和上转换材料荧光内滤的大肠杆菌快速检测方法，其特征在于，步骤2中，所述的pcr扩增反应程序为：95℃预变性3min，循环阶段步骤为：95℃变性15s，60℃复性15s，72℃延伸40s，进行34次循环，后72℃彻底延伸5min。通过该pcr扩增过程可以得到长度为372bp的核酸片段。
4.根据权利要求1所述的基于pcr和上转换材料荧光内滤的大肠杆菌快速检测方法，其特征在于，步骤3中，所述的六水...
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