【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物合成领域，具体涉及一种同时生产棕矢车菊素、泽兰林素的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用。
技术介绍
1、棕矢车菊素化学名为4'，5，7-三羟基-3，6-二甲氧基黄酮；泽兰林素（eupatilin），又称异泽兰黄素，化学名为5，7- 二羟基 -3'，4'，6- 三甲氧基黄酮，二者皆是主要存在于艾草等菊科蒿属植物中的黄酮类化合物，具有抗肿瘤、抗炎、抗糖尿病、抗氧化、抗突变、免疫抑制功能等药理活性，具有极高的药用价值，被广泛用于治疗胃炎和消化性溃疡。以棕矢车菊素和泽兰林素为主要活性成分的斯特兰片剂是由东亚制药公司与首尔大学推出的一款新药，具有显著的胃黏膜保护效果。
2、然而目前棕矢车菊素和泽兰林素的资源获取十分有限，严重限制了其药用价值的开发。艾草等植物中棕矢车菊素和泽兰林素含量低，目前普遍采用的传统提取分离方法不能保证产量，且品质易受气候、地域等因素影响；同时，棕矢车菊素和泽兰林素化学结构较复杂，具有多个甲氧基基团，采用化学合成法选择性低，且在环境、安全和效率等方面也存在诸多问题。因此，如何大量获取棕矢车菊素和泽兰林素以供新药研究和开发是一个亟待解决的问题。
3、微生物法合成化合物具有反应条件温和、可利用廉价碳源及酶催化特异性强等多重优势。已有研究表明，在大肠杆菌、酵母等微生物异源宿主中引入和表达天然植物途径是一种稳健且可持续的替代方案。目前为止，未见棕矢车菊素和泽兰林素异源生物合成的相关报道。酿酒酵母具有遗传背景清晰、公认安全、生长周期短、便于遗传操作且培养成本低廉等优点。因此，本专利技术以
技术实现思路
1、本专利技术提供一种同时合成棕矢车菊素和泽兰林素的酿酒酵母工程菌，所述酿酒酵母工程菌包括柚皮素的合成途径、6-oh木犀草素的合成途径、棕矢车菊素和泽兰林素的合成途径；所述柚皮素的合成途径为在酿酒酵母株系wat11上表达fjtal、pc4cl、smchs2和mschi；所述6-oh木犀草素的合成途径为在柚皮素合成的酿酒酵母中表达sbfnsii-1、atf3'h和sbf6h；所述棕矢车菊素和泽兰林素的合成途径为在6-oh木犀草素合成的酿酒酵母中表达mpalomt2、obfomt4。
2、本专利技术的另一实施方案提供上述可同时合成棕矢车菊素和泽兰林素的酿酒酵母工程菌，所述酿酒酵母工程菌的构建方法包括如下步骤：
3、（1）在酿酒酵母株系wat11中引入柚皮素的合成途径，得到柚皮素合成的酿酒酵母菌；
4、（2）在步骤（1）得到的柚皮素合成的酿酒酵母菌中引入6-oh木犀草素的合成途径，得到6-oh木犀草素合成的酿酒酵母菌；
5、（3）在步骤（2）得到的6-oh木犀草素合成的酿酒酵母菌中表达氧甲基转移酶3',4'-omt（mpalomt2）和6-omt（obfomt4），即可引入棕矢车菊素和泽兰林素的合成途径，得到所述酿酒酵母工程菌。
6、上述技术方案中，步骤（1）所述柚皮素的合成途径为在wat11上表达fjtal（酪氨酸解氨酶）、pc4cl（香豆酰辅酶a连接酶）、smchs2（查尔酮合酶）和mschi（查尔酮异构酶）。
7、步骤（2）所述6-oh木犀草素的合成途径为在柚皮素合成的酿酒酵母菌中表达sbfnsii-1（黄酮合酶）、atf3'h（黄酮3'-羟化酶）和sbf6h（黄酮6-羟化酶）。
8、本专利技术的另一实施方案提供一种同时合成棕矢车菊素和泽兰林素的酿酒酵母工程菌的构建方法，包括如下步骤：
9、（1）在酿酒酵母株系wat11中引入柚皮素的合成途径，得到柚皮素合成的酿酒酵母菌；
10、（2）在步骤（1）得到的柚皮素合成的酿酒酵母菌中引入6-oh木犀草素的合成途径，得到6-oh木犀草素合成的酿酒酵母菌；
11、（3）在步骤（2）得到的6-oh木犀草素合成的酿酒酵母菌中表达氧甲基转移酶3',4'-omt（mpalomt2）和6-omt（obfomt4），即可引入棕矢车菊素和泽兰林素的合成途径，得到所述酿酒酵母工程菌。
12、步骤（1）所述柚皮素的合成途径为在wat11上表达fjtal（酪氨酸解氨酶）、pc4cl（香豆酰辅酶a连接酶）、smchs2（查尔酮合酶）和mschi（查尔酮异构酶）。
13、步骤（2）所述6-oh木犀草素的合成途径为在柚皮素合成的酿酒酵母菌中表达sbfnsii-1（黄酮合酶）、atf3'h（黄酮3'-羟化酶）和sbf6h（黄酮6-羟化酶）。
14、本专利技术的另一实施方案提供一种同时合成棕矢车菊素和泽兰林素的酿酒酵母工程菌的构建方法，包括如下步骤：以酿酒酵母株系wat11为基础菌株，首先构建柚皮素的酵母合成途径，形成eu2；在 eu2中整合黄酮合酶fns、黄酮羟化酶f6h和f3'h基因的表达盒，构建6-oh木犀草素的合成途径，得到eu4；在eu4中整合氧甲基转移酶3'，4'-omt和6-omt的表达盒，得到eu6，即产棕矢车菊素和泽兰林素的酿酒酵母工程菌；所述eu2的基因信息为911b-up-psegal2-fjtal-tadh1/tcyc1-pc4cl-ptdh3-911b-do，1114a-up-adh1t-smchs-ptdh3-psegal2-mschi-tdh1t-1114a-do；所述eu4为在eu2的基础上导入两个基因表达盒：yprcd15c-up-pskgal2-sbfnsii-1-teno1-tadh1-atf3’h-psegal2-yprcd15c-do和607b-up-ptdh3-sbf6h-eno1t-607b-do；所述eu6为在eu4的基础上导入两个基因表达盒：1414a-up-tadh1-obfomt4-psegal2-1414a-do和416d-up-teno1-mpalomt2-1-pgal1-416d-do。
15、本专利技术的另一实施方案提供上述酿酒酵母工程菌在制备棕矢车菊素和/或泽兰林素中的应用。
16、本专利技术所述fjtal的dna序列为seq id no:1，其包含seq id no:2的氨基酸序列。
17、本专利技术所述pc4cl的dna序列为seq id no:3，其包含seq id no:4的氨基酸序列。
18、本专利技术所述smchs2的dna序列为seq id no:5，其包含seq id no:6的氨基酸序列。
19、本专利技术所述mschi的dna序列为seq id no:7，其包含seq id no:8的氨基酸序列。
20、本专利技术所述sbfnsii-1的dna序列为seq id no:9，其包含seq id no:10的氨基酸序列。
21、本专利技术所述atf3'h的dna序列为seq id no:11，其包含seq id no:12的氨基酸序列。
22、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种同时合成棕矢车菊素和泽兰林素的酿酒酵母工程菌，其特征在于所述酿酒酵母工程菌包括柚皮素的合成途径、6-OH木犀草素的合成途径、棕矢车菊素和泽兰林素的合成途径；所述柚皮素的合成途径为在酿酒酵母株系WAT11上表达FjTAL、Pc4CL、SmCHS2和MsCHI；所述6-OH木犀草素的合成途径为在柚皮素合成的酿酒酵母中表达SbFNSII-1、AtF3'H和SbF6H；所述棕矢车菊素和泽兰林素的合成途径为在6-OH木犀草素合成的酿酒酵母中表达MpalOMT2、ObFOMT4。
2.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于所述酿酒酵母工程菌的构建方法包括如下步骤：
3.一种同时合成棕矢车菊素和泽兰林素的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于包括如下步骤：以酿酒酵母株系WAT11为基础菌株，首先构建柚皮素的酵母合成途径，形成EU2；在 EU2中整合黄酮合酶FNS、黄酮羟化酶F6H和F3'H基因的表达盒，构建6-OH木犀草素的合成途径，得到EU4；在EU4中整合氧甲基转移酶3'，4'-O
5.权利要求1-2任一项所述的酿酒酵母工程菌在制备棕矢车菊素和/或泽兰林素中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种同时合成棕矢车菊素和泽兰林素的酿酒酵母工程菌，其特征在于所述酿酒酵母工程菌包括柚皮素的合成途径、6-oh木犀草素的合成途径、棕矢车菊素和泽兰林素的合成途径；所述柚皮素的合成途径为在酿酒酵母株系wat11上表达fjtal、pc4cl、smchs2和mschi；所述6-oh木犀草素的合成途径为在柚皮素合成的酿酒酵母中表达sbfnsii-1、atf3'h和sbf6h；所述棕矢车菊素和泽兰林素的合成途径为在6-oh木犀草素合成的酿酒酵母中表达mpalomt2、obfomt4。
2.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于所述酿酒酵母工程菌的构建方法包括如下步骤：
3.一种同时合成棕矢车菊素和泽兰林素的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于包括如下步骤：以酿酒酵母株系wat11为基础菌株，首先构建柚皮素的酵母合成途径，形成eu2；在 eu2中整合黄酮合酶fns、黄酮羟化酶f6h和f3'h基因的表达盒，构建6-oh木犀草素的合成途...
【专利技术属性】
技术研发人员：乔亚南，邹艳丽，李法辉，宋伟国，
申请(专利权)人：潍坊医学院，
类型：发明
国别省市：
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