本发明专利技术属于分子生物学和药物研发技术领域，公开了一种以CKLF1‑CCR4相互作用为靶标的药物筛选方法。通过融合蛋白载体构建与鉴定，条件优化筛选，构建了一种基于NanoBRET的以CKLF1‑CCR4相互作用为靶标的药物筛选系统。本发明专利技术能直观、快速、高通量评价具有影响CKLF1‑CCR4相互作用的潜在药物，为新型缺血性损伤及炎症免疫性疾病治疗药物的开发提供研究基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学和药物，具体涉及一种以cklf1-ccr4相互作用为靶标的药物筛选的方法。
技术介绍
1、趋化素样因子1(cklf1)是我国科学家首次克隆发现的趋化因子，对中性粒细胞、单核细胞等免疫细胞具有趋化活性，且参与多种炎症和免疫系统疾病的病理过程。研究显示， cklf1在正常生理情况下表达很低，当发生缺血性损伤包括脑缺血、肝缺血、心肌缺血时，cklf1在缺血组织中表达显著增高。此外，cklf1也被发现在多种免疫系统疾病，包括骨关节炎，类风湿性关节炎和强直性脊柱炎患者血浆、银屑病及异位性皮炎患者的皮肤组织、哮喘患者的肺组织等中显著增高。表明cklf1在缺血性损伤和炎症免疫性疾病中具有十分重要的作用。
2、c-c趋化因子受体4(ccr4)是cklf1的作用受体之一，已被证实与炎症反应、感染等多种病理生理过程密切相关，多项报道证明cklf1通过作用于ccr4参与多种生理病理作用。在脑缺血时，cklf1结合ccr4介导炎症小体nlrp3的激活与小胶质细胞的m1型极化。在哮喘疾病中，cklf1通过与ccr4结合引起异常的th2淋巴细胞趋化，导致哮喘相关的病理改变，该过程可能与nf-κb通路的激活有关。在银屑病等皮肤免疫炎症疾病中， cklf1与ccr4结合，引起表皮微血管内皮细胞增殖，参与银屑病的病理过程，且该效应可能与erk1/2-mapks的激活有关。因此，干预cklf1与ccr4的相互作用，拮抗cklf1在缺血性损伤及炎症免疫反应中的作用，对开发新型治疗缺血性损伤与炎症免疫性疾病药物具有重要意义。
3、炎症免疫性疾病包括哮喘、银屑病、关节炎、强直性脊柱炎等，是由多种免疫细胞参与的炎症疾病。炎症免疫疾病大多病程长，有容易复发的倾向，且有的疾病需要终身服药，对患者及社会带来了沉重的负担。然而目前许多炎症免疫疾病并无特效药，需要长期规范化服药控制病情，且许多炎症免疫性疾病及具体的病理机制仍然未彻底阐明。因此开发新的治疗炎症免疫疾病药物具有十分重大的意义。
4、缺血性损伤是指组织的供血受阻，因而出现的组织缺血导致的组织损伤，常见的缺血性损伤包括脑缺血、心肌缺血、肝缺血等。缺血性损伤疾病具有高致残率、高经济负担等特点，严重危害患者的生命健康，为社会带来沉重的负担。缺血性损伤的治疗药物目前存在适用范围窄，存在出血转化等诸多问题，临床使用受到限制，且针对缺血性损伤疾病并无特效药，因此亟待创新药物的开发。
5、现有的ccr4抑制剂筛选技术包括基于结构的虚拟筛选、ccr4过表达细胞的生理变化检测等。基于结构的虚拟筛选能够高通量地对化合物库进行筛选，能够快速对大量的化合物结构进行筛选，筛选成本低，且无需反复实验操作。然而其存在评价方法不完善等问题，不能够真实反应活细胞水平上的生物学效应，易出现假阳性及假阴性现象。利用ccr4过表达细胞能够在细胞水平高通量筛选ccr4抑制剂，但无法直接反映特定配体-受体相互作用的干预情况。常用于研究蛋白相互作用的方法主要有免疫共沉淀法，酵母双杂交技术，荧光能量共振转移(fret)、双分子荧光互补(bifc)等。目前已报道的cklf1-ccr4相互作用的检测体系为利用双分子荧光互补技术的检测体系，该检测体系将分开的荧光蛋白分别与目的蛋白连接，在目的蛋白相结合时产生荧光互补现象。该体系能够直观可视化监测cklf1-ccr4相互作用，而且可对其进行定位，然而其也存在定量效果不精确，结果容易受到细胞数量影响，高通量筛选数据处理较繁琐等缺点。
6、生物发光能量共振转移(bioluminescence resonance energy transfer,bret)是一种检测活细胞内蛋白相互作用的技术。当两个蛋白发生相互作用时，一个蛋白融合表达的供体荧光素酶基团的发射光光谱与另一个蛋白融合表达的受体荧光基团的激发光光谱重叠，从而诱发受体荧光基团发光，优势是无需激发光、避免光漂白、可进行活细胞水平的高通量检测，且由于是计算化学发光能量转移比，故不受细胞数目的影响，更适合于定量分析与药物筛选。
7、传统的bret技术存在荧光分子较大可能产生空间位阻，bret信号不强以及背景值较高等缺点。promega公司对传统bret方法进行改良，推出的新型nanobret技术，将nanoluc荧光素酶作为供体，halotag蛋白标记的nanobret 618荧光基团作为受体，使 bret分析信号更强，背景更低，可用于检测蛋白相互作用与药物筛选。
8、利用nanobret技术，可在体外进行快速高效的活细胞水平蛋白相互作用检测与药物筛选，可直接在细胞水平观察药物分子对于cklf1-ccr4相互作用的干预，具有不引入激发光，背景值低，无淬灭和光漂白效应等优势。然而，在目前的国内外关于cklf1-ccr4与缺血性损伤及炎症免疫性疾病治疗药物研究的相关报道中，均没有建立基于nanobret技术的以cklf1-ccr4相互作用为靶标的检测体系与药物筛选体系。通过分子克隆技术将nanoluc/halotag与cklf1/ccr4基因片段融合连接并共转染表达于活细胞内，添加相应的halotag荧光基团、待测化合物孵育，最后添加荧光素酶底物进行反应，测定化学发光能量转移比可在活细胞水平观察药物分子对于cklf1-ccr4相互作用的影响。
9、因此基于以上内容，提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术的解决的技术问题是提供一种以cklf1-ccr4相互作用为靶标的药物筛选方法，为制备或筛选促进或抑制cklf1-ccr4相互作用的化合物，筛选治疗缺血性损伤疾病、炎症免疫性疾病药物提供研究基础。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术采用了如下技术方案：
3、本专利技术技术方案的第一方面是提供了一种以cklf1-ccr4相互作用为靶标的药物筛选方法, 所述筛选方法包括以下步骤：
4、(1)使用分子克隆技术，将人ccr4基因/cklf1基因与nanoluc荧光素酶/halotag蛋白标签融合连接，得到融合蛋白质粒；
5、(2)使用脂质体转染法将优选的ccr4融合质粒与cklf1融合蛋白质粒组合按照优选的转染比例共转染入hek293t细胞；
6、(3)收集转染后的细胞，添加荧光配基halotag nanobret 618 ligand及待测化合物共孵育；
7、(4)添加nanoluc荧光素酶底物后，立即在460nm和615nm双滤光片条件下检测两波段化学发光强度，计算bret比值，以对照组为参照评价待测化合物对于cklf1-ccr4相互作用的影响。
8、所述的药物筛选方法，其特征在于：基于nanobret技术。
9、进一步的，利用分子克隆技术，将人cklf1基因与人ccr4基因与nanoluc或halotag连接构建融合蛋白质粒，得到8种不同组合的cklf1和ccr4融合蛋白质粒，分别为 halotag融合连接至cklf1的c端(cklf1-ht)；halotag融合连接本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种以CKLF1-CCR4相互作用为靶标的药物筛选方法,所述筛选方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的药物筛选方法，其特征在于：基于NanoBRET技术。
3.根据权利要求1所述的药物筛选方法，其特征在于：利用分子克隆技术，将人CKLF1/人CCR4基因与Halotag/NanoLuc融合连接，得到8种不同组合的融合蛋白质粒，分别为Halotag融合连接至CKLF1的C端；Halotag融合连接至CKLF1的N端；NanoLuc融合连接至CKLF1的C端；NanoLuc融合连接至CKLF1的N端；Halotag融合连接至CCR4的C端；Halotag融合连接至CCR4的N端；NanoLuc融合连接至CCR4的C端；NanoLuc融合连接至CCR4的N端。
4.根据权利要求3所述的药物筛选方法，其特征在于：转染质粒组合为的Halotag融合连接至CKLF1的N端的质粒与NanoLuc融合连接至CCR4的N端的质粒。
5.权利要求1-4任一项所述的药物筛选方法在制备或筛选促进或抑制CKLF1-CCR4相互作用的化合物中的应用。
6.权利要求1-4任一项所述的药物筛选方法在筛选治疗缺血性损伤疾病、炎症免疫性疾病药物中的应用。
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【技术特征摘要】
1.一种以cklf1-ccr4相互作用为靶标的药物筛选方法,所述筛选方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的药物筛选方法，其特征在于：基于nanobret技术。
3.根据权利要求1所述的药物筛选方法，其特征在于：利用分子克隆技术，将人cklf1/人ccr4基因与halotag/nanoluc融合连接，得到8种不同组合的融合蛋白质粒，分别为halotag融合连接至cklf1的c端；halotag融合连接至cklf1的n端；nanoluc融合连接至cklf1的c端；nanoluc融合连接至cklf1的n端；halotag融...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈乃宏，楚世峰，叶君锐，张钊，闫旭，
申请(专利权)人：中国医学科学院药物研究所，
类型：发明
国别省市：
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