【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体地说，涉及磷酸烯醇丙酮酸羧激酶突变体及其应用。
技术介绍
1、核苷是一类糖苷的总称。核苷是核酸和核苷酸的组成成分。核苷是由d-核糖或d-z-脱氧核糖与嘧啶碱或嘌呤碱缩合而成。核苷一般为无色结晶，不溶于普通有机溶剂，易溶于热水，熔点为160～240℃。由d-核糖生成的核苷称核糖核苷，参与rna组成，由d-α-脱氧核糖生成的核苷称脱氧核糖核苷，参与dna组成。d-核糖与腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶缩合生成相应的腺嘌呤核糖核苷、鸟嘌呤核糖核苷、胞嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶核糖核苷和尿嘧啶核糖核苷，它们分别简称为腺苷(a)、鸟苷(g)、胞苷(c)、胸苷(t)和尿苷(u)。
2、鸟嘌呤核苷(鸟苷)和次黄嘌呤核苷(肌苷)在食品和医药行业有着广泛的作用。在食品领域，鸟苷和肌苷分别是鸟苷酸二钠和肌苷酸二钠的重要前体，而鸟苷酸二钠与肌苷酸二钠组合使用作为食品增鲜剂，广泛应用于鸡精、酱油等调味品中。在医药领域，鸟苷和肌苷可以作为多种抗病毒药物的医药中间体，如无环鸟苷、三氮唑核苷、三磷酸鸟苷钠等都需要鸟苷作为合成原料。肌苷是肌苷酸的重要前体，而肌苷酸可以作为合成腺苷酸(amp)和鸟苷酸(gmp)的前体，适用于各种原因引起的白细胞减少症、血小板减少症、各种心脏疾患、急性及慢性肝炎、肝硬化等，此外还可治疗中心视网膜炎、视神经萎缩等。
3、腺苷即腺嘌呤核苷，化学名为6-氨基-9-β-d-呋喃核糖基-9-氢嘌呤，它是腺嘌呤核苷酸脱磷酸后的产物，属于重要的核苷酸衍生物。腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷，
4、目前，微生物发酵是生产核苷的主要方法，主要使用的微生物包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌或短小芽孢杆菌等。在生长菌株的选育与改造过程中，通过使用紫外诱变、硫酸二乙酯诱变育种，定向选育核苷高产菌株；或者根据细菌中核苷酸的代谢路径和调节机理，深入了解菌株遗传背景及菌株特性，通过代谢工程手段，有目的性地对菌株进行改造，以获得性状优良、能够高产核苷的生产菌株。但目前核苷菌种的发酵性能仍较差、核苷的转化率仍较低，难以满足大规模工业化生产的需求。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供磷酸烯醇丙酮酸羧激酶突变体及其应用。
2、本专利技术的另一目的是提供能够高效率生产核苷的新微生物。
3、为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供磷酸烯醇丙酮酸羧激酶突变体，所述突变体包含磷酸烯醇丙酮酸羧激酶第355位氨基酸由p到t的突变。
4、本专利技术中，来自枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶在ncbi上的参考序列编号为bsu_30560；
5、来自解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶在ncbi上的参考序列编号为bamf_2839。
6、第二方面，本专利技术提供编码所述突变体的核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组dna、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。
7、第三方面，本专利技术提供所述核酸分子或所述生物材料的以下任一应用：
8、(1)用于核苷的发酵生产；
9、(2)用于提高核苷的发酵产量；
10、(3)用于构建产核苷的基因工程菌。
11、其中，所述核苷包括肌苷、鸟苷、腺苷，或它们对应的核苷衍生物，如次黄嘌呤、肌苷酸、鸟嘌呤、鸟苷酸、核黄素、二乙酰鸟苷酸等。
12、第四方面，本专利技术提供产核苷的菌株的构建方法，利用基因工程手段，在微生物基因组中引入突变，使其编码的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶包含p355t突变位点。
13、所述微生物为具有核苷生产能力的微生物。
14、进一步地，所述方法包括进一步增强菌株中的pcka基因；
15、其中，解淀粉芽孢杆菌pcka基因在ncbi上的参考序列编号为bamf_2839；枯草芽孢杆菌pcka基因在ncbi上的参考序列编号为bsu_30560。
16、所述增强的途径选自以下1)～6)，或任选的组合：
17、1)通过导入具有所述基因的质粒而增强；
18、2)通过增加染色体上所述基因的拷贝数而增强；
19、3)通过改变染色体上所述基因的启动子序列而增强；
20、4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接而增强；
21、5)通过导入增强子而增强；
22、6)通过使用具有编码高活性的相应酶或蛋白质的基因或等位基因而增强。
23、优选地，增强方式为将pcka基因的原有启动子替换为强启动子；和/或
24、将pcka基因的拷贝数增加到二拷贝。
25、所述强启动子可选自p43、p41、plaps等。
26、所述微生物优选所述微生物为解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)或大肠杆菌(escherichia coli)等，更优选解淀粉芽孢杆菌836，菌株836可参见cn112574934a；枯草芽孢杆菌a5，菌株a5可参见cn110257315b。
27、第五方面，本专利技术提供按照所述方法构建得到的产核苷的菌株。
28、第六方面，本专利技术提供一种生产核苷的方法，所述方法包括如下步骤：
29、1)培养所述菌株，以获得微生物的培养物；
30、2)从步骤1)中获得的所述培养物中收集所产生的核苷。
31、借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：
32、本专利技术提供的突变菌株b.a8348(pckap355t点突变菌株)、b.a8349(pcka启动子强化菌株)、b.a8350(pcka二拷贝菌株)较出发菌相比，鸟苷产量由1.1g/l提高至3.0g/l、1.9g/l和2.3g/l。肌苷产量由0.6g/l分别提高至1.4g/l，1.4g/l和1.4g/l。腺苷生产菌株做了相应的改造后，其腺苷产量由出发菌的8.9g/l分别提高至10.0g/l、10.6g/l和10.1g/l，相应菌株的肌苷生产能力也有所提高，由1.1g/l分别提高至2.1g/l、1.6g/l和1.9g/l。
33、上述突变位点可应用于解淀粉芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌，但不限于上述两种菌，如短小芽孢杆菌、大肠杆菌等宿主菌，用于产肌苷、鸟苷、腺苷等核苷或对应的核苷衍生物，如次黄嘌呤、肌苷酸、鸟嘌呤、鸟苷酸、核黄素、二乙酰鸟苷酸等。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.磷酸烯醇丙酮酸羧激酶突变体，其特征在于，所述突变体包含磷酸烯醇丙酮酸羧激酶第355位氨基酸由P到T的突变；
2.编码权利要求1所述突变体的核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料；
3.权利要求2所述核酸分子或所述生物材料的以下任一应用：
4.核苷生产菌株的构建方法，其特征在于，利用基因工程手段，在微生物基因组中引入突变，使其编码的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶包含P355T突变位点；
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括进一步增强菌株中的pckA基因；
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将pckA基因的原有启动子替换为强启动子；
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将pckA基因的拷贝数增加到二拷贝。
8.根据权利要求4-7任一项所述的方法，其特征在于，所述微生物为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)或大肠杆菌(Escherichia co
9.按照权利要求4-8任一项所述方法构建得到的产核苷的菌株。
10.一种生产核苷的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.磷酸烯醇丙酮酸羧激酶突变体，其特征在于，所述突变体包含磷酸烯醇丙酮酸羧激酶第355位氨基酸由p到t的突变；
2.编码权利要求1所述突变体的核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料；
3.权利要求2所述核酸分子或所述生物材料的以下任一应用：
4.核苷生产菌株的构建方法，其特征在于，利用基因工程手段，在微生物基因组中引入突变，使其编码的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶包含p355t突变位点；
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括进一步增强菌株中的pcka基因；
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将pc...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛婷莉，吴涛，栾明月，姚嘉琪，张孟娟，杨晟，蒋宇，
申请(专利权)人：廊坊梅花生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：
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