【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于食品安全检测。更具体地，涉及一种提高19-去甲睾酮纳米抗体表达量及灵敏度的方法。
技术介绍
1、苯丙酸诺龙是动物源性动物常用的类固醇激素之一，广泛用于畜牧业中以促进蛋白质的合成、减少脂肪堆积、提高饲料报酬。但苯丙酸诺龙的滥用及残留会造成食品安全问题，因此，需要加强对食品中苯丙酸诺龙的检测。目前主要是以其次生代谢物19-去甲睾酮(19-nortestosterone，19-nt)作为苯丙酸诺龙残留检测的标志物，而对于19-去甲睾酮的检测常采用色谱法、质谱法、免疫分析法；而免疫分析法中，采用抗体进行检测具有快速、简便、灵敏度高等优点，近年来已成为食品安全检测常用手段，而核心试剂抗体的制备是免疫检测技术的关键。
2、纳米抗体(nanobody，nb)是驼科动物中轻链天然缺失、只有重链可变区的新型抗体分子，具有分子量小、可溶性好、稳定性高及易表达等优势，在免疫检测方面具有极大的应用潜力。中国专利cn111269320a公开了一种特异性识别19-去甲睾酮的纳米抗体nt8能够用于用19-去甲睾酮的检测，但其纳米抗体的表达量不高，灵敏度仍有待提高，限制了抗19-去甲睾酮纳米抗体的应用。
3、包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒。包涵体的新创：大肠杆菌没有哺乳动物细胞中携带的蛋白质翻译后修饰的细胞器及功能酶，导致中间体大量堆积，容易发生链间二硫键错配，加重包涵体的生成；包涵体的生成与蛋白本身的性质也有很大的关系，一般蛋白链内含多个半胱氨酸这
4、蛋白表达量高，合成速度快，越容易形成包涵体，但目前还鲜有研究通过增强包涵体的表达直接提升其活性蛋白表达量，因为包涵体的形成与包涵体的复性和纯化在生物、医药领域是非常重要的问题，同时也是一个很棘手的问题。一般包涵体中目的蛋白的含量高，约50％，可以高效的获得目的蛋白，但是只能先尿素或盐酸胍变性后重新复性才能恢复其生物活性，且活性水平一般都较差，所以包涵体的使用难度较大。如果从包涵体组分能高效的制备出高活性的蛋白，包涵体的使用无疑是有重要应用意义的。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是克服现有抗19-去甲睾酮纳米抗体nt8表达量不高，灵敏度较低以及包涵体无生物活性等问题，提供一种提高19-去甲睾酮纳米抗体表达量及灵敏度的方法。
2、本专利技术的目的是提供一种提高19-去甲睾酮纳米抗体表达量及灵敏度的方法。
3、本专利技术另一目的是提供一种高表达量、高灵敏度的抗19-去甲睾酮纳米抗体。
4、本专利技术又一目的是提供一种检测19-去甲睾酮的方法。
5、本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：
6、本专利技术提供一种提高19-去甲睾酮纳米抗体表达量及灵敏度的方法，包含如下步骤：
7、s1.将19-去甲睾酮纳米抗体融合硫氧还蛋白a构建表达载体，并转化至大肠杆菌表达宿主中进行诱导表达，得到菌体中的不溶组分即为纳米抗体包涵体表达组分；
8、s2.将纳米抗体包涵体表达组分通过一步法进行变性、复性、纯化和脱盐处理，即得高表达量及灵敏度的19-去甲睾酮纳米抗体。
9、进一步地，步骤s1中19-去甲睾酮纳米抗体为纳米抗体nt8，其氨基酸序列如seqid no.1所示。
10、本专利技术提供的方法能显著提高19-去甲睾酮纳米抗体表达量及灵敏度，通过将纳米抗体nt8融合硫氧还蛋白a(trxa)，构建重组表达载体pet-32a-nbnt8，通过优化大肠杆菌表达宿主，诱导剂浓度，诱导温度最终得到纳米抗体包涵体表达量最高的表达体系；并同优化纳米抗体包涵体变性工作液的配方，建立纳米抗体包涵体一步法进行柱上复性、纯化及脱盐，最终制备的纳米抗体trxa-nbnt8表达量可达65mg/l培养基。包涵体是没有活性的目的蛋白固体，优化包涵体变性缓冲液、包涵体复性缓冲液的配方，可以提高包涵体的提取效率及复性后蛋白的活性水平。同时，本专利技术建立的ic-elisa方法检测19-去甲睾酮，采用纳米抗体trxa-nbnt8的检测限低至0.877pg/ml，线性范围为3.71-514.09pg/ml，灵敏度43.67pg/ml。比原始pcomb3xss载体周质空间表达的纳米抗体nt8灵敏度(1.53ng/ml)提高了35.04倍。
11、进一步地，步骤s1中采用携带强启动子t7lac的pet-32a表达载体，可以经乳糖类似物iptg诱导高效率的启动乳糖操纵子，诱导目的蛋白快速表达；所述载体利用基因工程技术易于克隆、非常适合用于构建表达载体。
12、进一步地，步骤s1中大肠杆菌表达宿主为bl21de3、overexpress c43(de3)、rosetta de3、rosetta gamib de3或top 10f’。
13、优选地，大肠杆菌(e.coli)表达宿主采用bl21de3，将构建的pet-32a-trxa-nbnt8于e.coli bl21de3中构建表达工程菌。
14、进一步地，步骤s1中诱导表达条件为：在0.125～1mm iptg，20～37℃条件下诱导表达10～12h。
15、优选地，中诱导表达条件为：在1mm iptg，25℃条件下诱导表达12h。
16、进一步地，步骤s2中一步法为通过在柱上一步进行包涵体复性+纯化+脱盐，纯化采用akta pure和ni sepharose 6fast flow纯化仪器和材料进行。
17、进一步地，步骤s2中变性采用含20mm tris-hcl，0.5m nacl，6m盐酸胍，5mm咪唑，1mmβ-巯基乙醇，ph 8.0的变性缓冲液进行处理；然后采用含20mm tris，0.5m nacl，6m尿素，20mm咪唑，1mmβ-巯基乙醇，ph 8.0的包涵体变性增强液进行二次变性处理。
18、优选地，将不溶组分经包涵体洗涤液(20mm tris，0.5m尿素，0.5m nacl，2％tween-20，ph 8.0)室温洗涤5min后二次离心收集沉淀，采用包涵体变性缓冲液室温重悬包涵体，振荡30min，离心收集上清；采用akta pure、ni sepharose 6fast flow和脱盐柱实现复性、纯化和脱盐处理，先换用包涵体变性缓冲液进行柱平衡，恒定流速0.5ml/min上样，随后将流动相切换为包涵体变性增强液，流速1ml/min。
19、进一步地，步骤s2中复性采用含20mm tris，0.5m nacl，20mm咪唑，1mmβ-巯基乙醇，0.3m精氨酸，ph 8.0的包本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种提高19-去甲睾酮纳米抗体表达量及灵敏度的方法，其特征在于，包含如下步骤：
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1中19-去甲睾酮纳米抗体为纳米抗体NT8，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1中采用携带强启动子T7lac的pET-32a表达载体。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1中大肠杆菌表达宿主为BL21DE3、OverExpress C43(DE3)、Rosetta DE3、Rosetta gamiB DE3或Top 10F’。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1中诱导表达条件为：在0.125～1mMIPTG，20～37℃条件下诱导表达10～12h。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S2中变性采用含20mM Tris-HCl，0.5MNaCl，6M盐酸胍，5mM咪唑，1mMβ-巯基乙醇，pH 8.0的变性缓冲液进行处理；然后采用含20mMTris，0.5M NaCl，6M尿素，20mM咪唑，1mMβ-巯
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S2中复性采用含20mM Tris，0.5M NaCl，20mM咪唑，1mMβ-巯基乙醇，0.3M精氨酸，pH 8.0的包涵体复性缓冲液与包涵体变性增强液混合处理。
8.一种高表达量、高灵敏度的抗19-去甲睾酮纳米抗体，其特征在于，经过权利要求1～7任一所述方法处理得到。
9.一种检测19-去甲睾酮的方法，其特征在于，采用权利要求8所述抗19-去甲睾酮纳米抗体进行检测。
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，进行间接竞争检测，采用包被原的包被浓度为0.25～1μg/mL。
...【技术特征摘要】
1.一种提高19-去甲睾酮纳米抗体表达量及灵敏度的方法，其特征在于，包含如下步骤：
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤s1中19-去甲睾酮纳米抗体为纳米抗体nt8，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤s1中采用携带强启动子t7lac的pet-32a表达载体。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤s1中大肠杆菌表达宿主为bl21de3、overexpress c43(de3)、rosetta de3、rosetta gamib de3或top 10f’。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤s1中诱导表达条件为：在0.125～1mmiptg，20～37℃条件下诱导表达10～12h。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤s2中变性采用含20mm tris-hcl...
【专利技术属性】
技术研发人员：王弘，方如玉，沈兴，沈玉栋，杨金易，徐振林，孙远明，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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