一种重组人粒细胞刺激因子的纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，采用的大肠杆菌表达重组人粒细胞刺激因子ｒｈＧ－ＣＳＦ为包涵体形式，包括下述纯化步骤：（１）采用优化的包涵体洗涤液配方进行洗涤，获得高纯度的包涵体；（２）对洗涤后的包涵体样品进行超滤复性；（３）复性后样品通过Ｃａｐｔｏ?ＶｉｒａｌＱ柱层析；（４）然后通过Ｓｕｐｅｒｄｅｘ?７５凝胶过滤柱层析，得到纯化后的重组人粒细胞刺激因子ｒｈＧ－ＣＳＦ原液。本发明专利技术具有工艺简便快速，步骤少，收率高，纯度高，样品各项指标均符合欧洲药典要求，在兼顾环保的同时，提高药品的安全性、可控性和有效性的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。属于蛋白质纯化领域，是简 单高效地制备高纯度，高收率的药用rhG-CSF原液的方法。
技术介绍
rhG-CSF是调节骨髓中粒系造血的主要细胞因子之一，选择性作用于粒系造 血祖细胞，促进其增殖、分化，并可增加粒系终末分化细胞的功能。人G-CSF的氨基酸 序列为TPLGPASSLP QSFLLKCLEQVRKIQGDGAA LQEKLCATYK LCHPEELVLL GHSLGIPWAP LSSCPSQALQLAGCLSQLHS GLFLYQGLLQ ALEGISPELG PTLDTLQLDV ADFATTIWQQMEELGMAPAL QPTQGAMPAF ASAFQRRAGG VLVASHLQSF LEVSYRVLRHLAQP1991年，第一个通过大肠杆菌表达系统生产的rhG-CSF药物 Filgrastim(Neupogen，r-metHuG-CSF，Amgen Inc)在美国上市，1993 年，通过 CH0 表达系统W^C N"irnW rhG-CSF Lenograstim(Granocyte,Chugai PharmaceuticalCo. Ltd.)在欧洲上市。此后，国内外又有多家公司的rhG-CSF药物上市。目前报道的关于G-CSF的专利，其主要的研究方向以下几种情况(1)通过改变表 达体系，提高表达量如中国专利申请200810113138. 7报道了 G-CSF连接信号肽，目的蛋白 在工程菌周质腔表达；(2)改进发酵工艺，如通过高密培养，改变培养基配方，培养条件等 手段，实现工程菌的高表达，但这些方面目前并无实质性的突破，而只是作为与生产工艺的 一部分被提及；(3)优化复性工艺、纯化步骤，如中国专利96106418.8报道了使用中空纤维 超滤透析复性方法，中国专利申请200410027943. x报道了通过2次复性以及超滤处理样品 对纯化过程进行优化；中国专利申请200410007171. 3报道了一步法纯化rhG-CSF，纯化产 物纯度达到95%以上，可用于G-CSF的进一步修饰；中国专利申请200510045388. 8报道了 先对G-CSF进行初步纯化，再进行复性，使原液细菌内毒素残留量水平明显降低，复性率提 高。中国专利申请200810064653报道了使用反相色谱法精细纯化G-CSF的专利。以上专利报道中对于检测方法的描述往往比较含糊或不提及，这样就很难对纯化 后样品的纯度究竟达到何程度有明确的认识，给评价不同专利中提到的纯化方法带来了困 难。以达到95%的纯度为例，电泳纯度与液相色谱纯度可能有极大的区别；基于不同分离 原理的液相色谱纯度检测方法来评价同一样品，得到的结果也大相径庭；同一种型号的柱 子，当检测条件不同时，对杂质的检出率也有明显区别。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术的目的在于提供了一种重组人粒细胞刺激因子的纯化 方法，本专利技术具有工艺简便快速，步骤少，收率高，纯度高，样品各项指标均符合欧洲药典要 求，在兼顾环保的同时，提高药品的安全性、可控性和有效性的特点。为达到上述的目的，本专利技术采用如下技术方案，采用的大肠杆菌表达重组人粒细胞刺激因子rhG-CSF为包涵体形式，包括下述纯化步骤(1)采用优化的包涵体洗涤液配方进行洗涤，获得高纯度的包涵体；(2)对洗涤后的包涵体样品进行超滤复性；(3)复性后样品通过Capto ViralQ柱层析；(4)然后通过Superdex 75凝胶过滤柱层析，得到纯化后的重组人粒细胞刺激因 子rhG-CSF原液。所述的步骤(1)中包涵体洗涤液配制如下EDTA ImM ；盐酸胍2M ；pH8. 5士0. 05的 Tris-HCl 50mM ；Nacl 50mM。所述的步骤(2)中超滤复性条件为包涵体溶于包涵体溶解液中，溶解后的包涵 体样品，采用10mM/L的DTT还原剂，充氮避光2小时后，加入复性液中混勻后开始超滤，采 用恒体积透析，在超滤系统内保持体积和浓度恒定，跨膜压力(TMP)不大于50psig，使流加 的洗滤液速度与透出液速度相同，共稀释复性45 80分钟。所述的包涵体溶解液配方为盐酸胍6M ；pH8. 5士0. 05的Tris_HC150mM ； Nacl40mMo所述的复性液配方为盐酸胍4M ；pH8. 5士0. 05Tris_HC150mM ；Nacl20mM。所述的步骤(3)中的Capto ViralQ柱层析采用的洗脱液为pH7. 5 士0. 05的50mM 磷酸盐和0. 23M Nacl。所述的步骤(4)中的Superdex 75凝胶过滤层析采用的洗脱液为50mM醋酸盐缓 冲液。本专利技术的有益效果是(1)独特的包涵体洗涤步骤，为后续的纯化奠定了基础。(2)工艺简单，步骤少。复性后样品的纯度已达到90%以上；1步柱层析将样品纯 化至药用要求；样品只经过2步纯化，即可得到原液。(3)原液质量超过中国药典要求，符合欧洲药典EP6. 3版的标准，反相色谱纯度 (CP法)达到99%以上，排阻色谱纯度达到99%以上，反相色谱纯度(EP)法达到98%以 上，残余工程菌蛋白含量低于0. 005%，低于国家标准的10分之1，细菌内毒素每毫克低于 0. 25EU，仅相当于国家标准的120分之1 (标准为10EU/300 u g)。(4)高载量、高流速处理大体积样品，大大缩短工艺时间，可进行大规模生产工 艺单批规模可达到100g以上。本专利技术紧密结合先进的质量检测手段，确证纯化效果达到要求。包涵体洗涤前后 进行了电泳考察对比；2步层析柱后样品均进行了电泳和液相双检测；对于原液的检测不 仅使用了电泳和液相色谱法同时检测，而且仅针对反相色谱，就同时使用了欧洲药典方法 和中国药典方法的同时检测。本工艺实现了以下几个目的独特的样品预处理；柱层析步 骤少；工艺收率高，规模大；样品质量高，用目前已知的最严格的药用国际标准来控制样品 质量。本专利技术的另一个明显优势是完全避免了强有机溶剂在生产工艺中的使用。乙腈 和甲醇是一种常见的纯化用试剂，以达到蛋白质精细纯化，获得高纯度的目的。当在规模化 生产中使用反相色谱方法进行蛋白的纯化时，乙腈和甲醇等有机溶剂的用量很大，它们都 属于有毒性的溶剂，大量使用有机溶剂带来一系列的问题不仅价格昂贵，生产成本过高；样品中的残余溶剂可能带来安全性隐患；废水的处理会产生大量的环保处理费用；如排放 到环境中，将对环境带来污染。本工艺在不降低任何收率和纯度指标的情况下，避免使用有 机溶剂，优点突出。附图说明图1是本专利技术包涵体洗涤前后SDS-PAGE电泳图谱；图2是本专利技术复性样品和纯化中间体SDS-PAGE电泳图谱；图3是本专利技术复性后样品的HPLC图谱；图4是本专利技术样品通过Capto ViralQ柱后样品的HPLC图谱；图5是本专利技术样品通过Superdex 75凝胶过滤后样品的HPLC图谱； 图6是本专利技术rhG-CSF原液SDS-PAGE电泳图谱；图7是本专利技术rhG-CSF原液HPLC-RPC图谱(中国药典法)；图8是本专利技术rhG-CSF原液HPLC-RPC图谱(欧洲药典法)。具体实施例方式下面通过具体实施例，对本专利技术作进一步的描述。本实施例采用的大肠杆菌表达重组人粒细胞刺激因子rhG-CSF为包涵体形式，首 先采用优本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，采用的大肠杆菌表达重组人粒细胞刺激因子ｒｈＧ－ＣＳＦ为包涵体形式，其特征在于包括下述纯化步骤：　　（１）采用优化的包涵体洗涤液配方进行洗涤，获得高纯度的包涵体；　　（２）对洗涤后的包涵体样品进行超滤复性；（３）复性后样品通过Ｃａｐｔｏ　ＶｉｒａｌＱ柱层析；　　（４）然后通过Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　７５凝胶过滤柱层析，得到纯化后的重组人粒细胞刺激因子ｒｈＧ－ＣＳＦ原液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙黎，蔡慧丽，何艳，杨美花，裴广强，林崧，余东新，
申请(专利权)人：厦门特宝生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：92[中国|厦门]