人血清白蛋白与人粒细胞集落刺激因子的融合蛋白的制备方法及产品技术

人血清白蛋白与人粒细胞集落刺激因子的融合蛋白的制备方法及产品，属于长效融合蛋白药物技术领域。本发明专利技术利用重叠ＰＣＲ技术，将ＨＳＡ基因ｃＤＮＡ和Ｇ－ＣＳＦ　　ｃＤＮＡ进行拼接，中间不加入任何连接肽，得到的ＨＳＡ－ＧＣＳＦ　　ｃＤＮＡ融合基因在宿主系统中进行表达，融合基因被整合到宿主的染色体中；本发明专利技术的融合蛋白包括与人血清白蛋白至少８５％序列同源的第一区和与人粒细胞集落刺激因子至少８５％序列同源的第二区，该融合蛋白可以在不改变融合蛋白特性的前提下，进行个别氨基酸残基的取代、缺失或加入；宿主系统可以是细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞等。本发明专利技术的融合蛋白在保持了人粒细胞集落刺激因子的生理特性的基础上延长其在体内的半衰期，在药学领域有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
人血清白蛋白与人粒细胞集落刺激因子的融合蛋白的制备方法，其特征是从新鲜人外周血中分离单核淋巴细胞，刺激培养，提取ＲＮＡ，通过ＲＴ－ＰＣＲ反转录得到Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ；通过ＰＣＲ从人胎肝ｃＤＮＡ文库中扩增获得ＨＳＡｃＤＮＡ；利用重叠Ｐ ＣＲ技术，连接ＨＳＡｃＤＮＡ和Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ，中间不加入任何连接肽，得到的ＨＳＡ－ＧＣＳＦｃＤＮＡ融合基因插入到克隆载体，ＨＳＡ－ＧＣＳＦｃＤＮＡ融合基因在宿主系统进行表达，ＨＳＡ－ＧＣＳＦｃＤＮＡ融合基因被整合到宿 主的染色体中；（１）Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ的克隆：以反转录ＰＣＲ得到的Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ第一链为模板，通过ＰＣＲ扩增出Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ，所用的引物如下：ｐ１：５’－ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＣＣＣＣＣＣＴＧＧ ＧＣＣＣＴＧＣ－３’ｐ２：５’－ＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＧＣ－３’ＰＣＲ方法如下：５０μｌ的反应体系中加入：１０μｍｏｌ／Ｌ的ｐ１和ｐ２的引物各１．５μｌ，２ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰ５μｌ， １０×ｐｆｕＢｕｆｆｅｒ５μｌ，５Ｕ／μｌ的ｐｆｕＤＮＡ聚合酶０．５μｌ，Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ第一链１μｇ，加双蒸水补齐５０μｌ，ＰＣＲ条件为：９５℃变性１０分钟，９４℃变性１分钟，６６．５℃退火１分钟，７２℃延伸９０秒，循环３５ 次；通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用ＰＣＲ片段胶回收试剂盒纯化出０．５ｋｂ的目标片段，纯化好的目标片段和载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＫＳ（＋）分别经ＥｃｏＲⅠ和ＮｏｔⅠ双酶切；琼脂糖凝胶电泳纯化，用 ＰＣＲ片段胶回收试剂盒回收，用Ｔ↓［４］连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞，转化物涂布于含有Ｘ－ｇａｌ、ＩＰＴＧ和１００μｇ／ｍｌ氨苄青霉素的ＬＢ琼脂平板，３７℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于２０ｍｌ含１００μｇ／ｍｌ氨苄青霉素的ＬＢ培养基中３７℃培养过夜，提取质粒；通过ＰＣＲ，及ＥｃｏＲⅠ和ＮｏｔⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒ＥｃｏＲⅠ和ＮｏｔⅠ双酶切位点间区域进行ＤＮＡ测序；阳性重组子保存在含有２０％甘油的ＬＢ中，冻于－８０℃；重组质粒命名为ｐＢｌｕｅ－ＧＣＳＦ，阳性重组子命名为ＤＨ５α／ｐＢｌｕｅ－ＧＣＳＦ；（２）ＨＳＡｃＤＮＡ的克隆：...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：金坚，张莲芬，徐钰，许正宏，雷楗勇，窦文芳，史仲平，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]