一种制备重组人粒细胞集落刺激因子用工程菌的发酵方法，所述工程菌为ＤＨ５α－ＰＢＶ２２０－ｈＧＣＳＦ，其发酵过程包括种子液培养，包括以下子步骤：①．菌种的筛选；②．一级种子液培养；③．二级种子液培养；和分批补料发酵，包括以下子步骤：①．发酵前的准备；②．基本发酵：按接种量１０％体积比接入二级种子液，３０℃，培养８小时，开始诱导表达；③．诱导发酵：诱导温度为４２℃，诱导４小时，结束发酵；上述分批补料发酵子步骤②和③中，控制ｐＨ为７．０－７．１，溶氧值为５０％；并且当ＯＤ↓［６００］值为２时，开始补料，每小时补加一定量的补料Ⅰ和Ⅱ。本发酵方法，为解决人粒细胞集落刺激因子制备上存在的表达率偏低、菌体产量偏低、活性偏低以及成本偏高等问题提供了可能。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及药用蛋白物质的制备，尤其涉及对用于制备目的蛋白的基因重组工程菌进行发酵的方法，特别涉及。
技术介绍
1985年Welte.K成功地从人膀胱癌细胞株5637的培养上清液中纯化并精制出人粒细胞集落刺激因子(以下简称hG-CSF)，然后Welte.K与美国的AMGEN公司的Souza.L.M又进一步确定这种hG-CSF的N段氨基酸排列顺序，将来源于5637细胞株的hG-CSF基因克隆化，采用基因工程技术将该基因插入大肠杆菌成功地制得hG-CSF而开发出重组人粒细胞集落刺激因子(以下简称rhG-CSF)，商品名为Filgratin(惠尔血)。该药1991年美国FDA批准上市。hG-CSF由CHO细胞(中华仓鼠卵巢细胞)产生的rhG-CSF来源于人口腔底细胞的基因Granocyte(格拉诺塞特)是一种含有174个氨基酸的糖蛋白，其氨基酸序列和糖链组分与人体G-CSF相同。内毒素、TNF-α和IFN-γ可活化单核细胞和巨噬细胞产生G-CSF。此外，成纤维细胞、内皮细胞、星状细胞和骨髓基质细胞等在LPS、IL-1或TNF-α刺激活化后也可分泌G-CSF。某些白血病细胞以及CHu-2人口腔癌细胞、5637人膀胱癌细胞、MIAPa Ca-2胰腺癌细胞可组成性地表达G-CSF。1986年G-CSF cDNA克隆成功，G-CSF基因全长2.5kb，包括5个外显子和4个内含子。人类有两种不同的G-CSF cDNA，分别编码含207和204氨基酸的前体蛋白，均有30个氨基酸的先导序列，成熟蛋白分子分别为177和174个氨基酸，前者除了在成熟分子N端35位处插入了3个氨基酸外，其余的序列与174氨基酸分子相同。人G-CSF分子量为19.6kDa，PI6.1，O-糖基化，对酸碱(pH2～10)、热以及变性剂等相对较稳定。G-CSF有5个半胱氨酸，Cys 36与Cys42，Cys74与Cys64之间形成两对二硫健，Cys17为不配对半胱氨酸，二硫键对于维持G-CSF生物学功能是必须的因素。G-CSF主要作用于中性粒细胞系(lineage)造血细胞的增殖、分化和活化。在体外G-CSF刺激骨髓造血祖细胞中中性粒细胞集落的形成，延长成熟中性粒细胞的存活时间，活化中性粒细胞，促进其ADCC，超氧阴离子的产生和碱性磷酸酶的合成。最近研究表明，单独G-CSF或与SCF协同可促进多能造血干细胞的增殖、干细胞母细胞集落形成以及体内CFU-S的形成。G-CSF还具有对人粒细胞、单核细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞以及成肌纤维细胞的趋化作用。肿瘤患者注射G-CSF后可提高血循环中中性粒细胞的水平，这种作用可能与缩短某些骨髓细胞进入S期的时间以及增加生成粒细胞的祖细胞数量有关。申请人深圳新鹏生物工程有限公司生产的rhG-CSF，商品名为瑞血新，采用工程菌DH5α-PBV220-hGCSF制备而成，含有175个氨基酸，分子量为18.8kDa，等电点6.2±0.4，除第一个氨基酸外，其他174个氨基酸排列顺序与天然人体的G-CSF序列完全相同，在中国获得批准上市，可适用于癌症放、化疗等原因引起的白细胞减少症，是肿瘤放、化疗过程中重要的辅助用药。目前，国内外生产的各种rhG-CSF商品都已经应用到临床，并取得了很好的效果。人们也在寻求简化rhG-CSF制备工艺，增加制品的活性，降低成本的各种各样的方法。这些方法可以分化为三类第一种方法是从能够分泌rhG-CSF的重组基因工程菌菌株入手，以期获得获得产量高的、便于后期提取处理的菌种，如中国专利ZL98103011.4和中国专利申请01800753.8各公开了一种分泌rhG-CSF的大肠杆菌菌株；第二种方法是能够从对重组基因工程菌菌株进行高密度、快速培育入手，虽然大量文献提到菌株的培养，但大多是轻描淡写，没有对该种方法予以深入研究和分析，换句话来说，就是在该领域一直以来没有好的突破；第三种方法则是从rhG-CSF的提取、纯化入手，如中国专利ZL96106418.8中公开了一种采用外压式中空纤维超滤透析复性，以离子交换柱层析、疏水柱层析和分子筛柱层析顺序组合纯化以制备高纯度药用rhG-CSF蛋白方法。现有技术在如何从对重组基因工程菌菌株进行高密度、快速培育入手，以解决rhG-CSF的制备上始终存在表达率偏低、菌体产量偏低、活性偏低以及成本偏高等问题方面，一直以来没有好的解决方案。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，从对重组基因工程菌菌株进行高密度、快速培育入手，来解决rhG-CSF的制备上存在的表达率偏低、菌体产量偏低、活性偏低以及成本偏高等问题。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案是，提出一种，所述工程菌为DH5α-PBV220-hGCSF，其发酵过程包括步骤种子液培养和分批补料发酵，所述种子液培养包括以下子步骤①.菌种的筛选从菌种保存库中取出所述工程菌，划LB平板30℃培养过夜，挑取单菌落接种于含100μg/ml氨苄青霉素的5mlLB试管中培养，至OD600值为0.4-0.6，再于42℃培养4小时，离心收集菌体，SDS-PAGE分析，用重组人粒细胞集落刺激因子表达量最高的克隆作为发酵用种子，分装甘油保存，每批发酵取用一支；②.一级种子液培养将种子按2％的体积比接种到含2YT种子培养基的50ml三角瓶中，30℃，200r/min摇床培养，至OD600值为0.6-1.0；③.二级种子液培养将一级种子液以1％的体积比接种到含200ml 2YT种子培养基的500ml三角瓶中，30℃，250r/min，摇床培养12-16小时，至OD600值为3.5-6.5，镜检无杂菌，菌种形态正常，即为发酵用种子；所述分批补料发酵包括以下子步骤①.发酵前的准备将8L发酵培养基接入20L的发酵罐中，115℃灭菌30分钟；②.基本发酵灭菌后，待培养基温度降到30℃时，按接种量10％体积比接入二级种子液，30℃，培养8小时，开始诱导表达；③.诱导发酵诱导温度为42℃，诱导4小时，结束发酵；上述分批补料发酵子步骤②和③中，通过补加4mol/LNaOH(氢氧化钠)控制pH为7.0-7.1，通过调节发酵罐的空气流速和转速，控制溶氧值为50％；并且当OD600值为2时，开始补料，补料方式为每小时补加补料I和II各100ml。所述发酵培养基的配方为蛋白胨20g，酵母粉120g，甘油40ml，硫酸铵50g，葡萄糖100g，氯化钠5g，磷酸氢二钾100g，磷酸二氢钾20g，加纯化水定容至8L。所述补料I的配方为葡萄糖300g，硫酸铵50g，加纯化水定容至1L。所述补料II的配方为酵母粉300g，酪蛋白水解物20g，维生素B10.1g，加纯化水定容至1L。同现有技术相比较，采用本专利技术的，为解决rhG-CSF的制备上存在的表达率偏低、菌体产量偏低、活性偏低以及成本偏高等问题提供了可能。具体实施例方式以下对本专利技术予以进一步详尽说明。本专利技术的一种，所述工程菌为DH5α-PBV220-hGCSF，其发酵过程包括种子液培养和分批补料发酵，所述种子液培养包括以下子步骤①.菌种的筛选从菌种保存库中取出所述工程菌，划LB平板30℃培养过夜，挑取单菌落接种于含100μg/ml氨苄青霉素的5ml LB试管中培养，至OD600值为0.本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备重组人粒细胞集落刺激因子用工程菌的发酵方法，所述工程菌为ＤＨ５α－ＰＢＶ２２０－ｈＧＣＳＦ，其发酵过程包括种子液培养和分批补料发酵，其特征在于：所述种子液培养包括以下子步骤：①．菌种的筛选：从菌种保存库中取出所述工程 菌，划ＬＢ平板３０℃培养过夜，挑取单菌落接种于含１００μｇ／ｍｌ氨苄青霉素的５ｍｌＬＢ试管中培养，至ＯＤ↓［６００］值为０．４－０．６，再于４２℃培养４小时，离心收集菌体，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，用重组人粒细胞集落刺激因子表达量最高的克隆 作为发酵用种子，分装甘油保存，每批发酵取用一支；②．一级种子液培养：将种子按２％的体积比接种到含２ＹＴ种子培养基的５０ｍｌ三角瓶中，３０℃，２００ｒ／ｍｉｎ摇床培养，至ＯＤ↓［６００］值为０．６－１．０；③．二级种子液培养： 将一级种子液以１％的体积比接种到含２００ｍｌ２ＹＴ种子培养基的５００ｍｌ三角瓶中，３０℃，２５０ｒ／ｍｉｎ，摇床培养１２－１６小时，至ＯＤ↓［６００］值为３．５－６．５，镜检无杂菌，菌种形态正常，即为发酵用种子；所述分批补料发酵 包括以下子步骤：①．发酵前的准备：将８Ｌ发酵培养基接入２０Ｌ的发酵罐中，１１５℃灭菌３０分钟；②．基本发酵：灭菌后，待培养基温度降到３０℃时，按接种量１０％体积比接入二级种子液，３０℃，培养８小时，开始诱导表达；③． 诱导发酵：诱导温度为４２℃，诱导４小时，结束发酵；上述分批补料发酵子步骤②和③中，通过补加４ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠控制ｐＨ为７．０－７．１，通过调节发酵罐的空气流速和转速，控制溶氧值为５０％；并且当ＯＤ↓［６００］值为２时，开始补料，补 料方式为每小时补加补料Ⅰ和Ⅱ各１００ｍｌ。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李政海，李静，李继东，
申请(专利权)人：深圳新鹏生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]
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