同时检测西番莲三种制造技术

本发明专利技术公开了同时检测西番莲三种

【技术实现步骤摘要】
同时检测西番莲三种RNA病毒的多重RT
‑
PCR引物组及其方法


[0001]本专利技术属于植物病毒检测
，尤其涉及西番莲三种
RNA
病毒的多重
RT
‑
PCR
引物组及其方法
。

技术介绍

[0002]西番莲
(
俗称百香果
)
，西番莲在栽培生产过程中，病毒病的发生日益严重，已成为影响其产量和品质的第二大病害
。
东亚西番莲病毒
(EastAsian Passiflora virus
，
EAPV)、
夜来香花叶病毒
(telosma mosaicvirus
，
TeMV)
和黄瓜花叶病毒
(cucumber mosaic virus
，
CMV)
是当前危害我国西番莲的主要病毒种类
。
其中，
EAPV、TeMV
是近年来我国西番莲上新报道的2种马铃薯
Y
病毒科马铃薯
Y
病毒属病毒
。EAPV
侵染西番莲后引起叶片花叶
、
果实畸形和木质化等症状，能引起西番莲木质化病，造成的危害十分严重，西番莲商品价值几乎完全丧失
。TeMV
侵染西番莲后能引起一系列症状，包括叶片花叶
、
卷曲和果实斑驳
、
小果等，造成西番莲产量和品质大幅度下降
。CMV
为雀麦花叶病毒科黄瓜花叶病毒属成员，是国际上最重要的十大植物病毒之一，该病毒侵染西番莲能引起环斑
、
花叶
、
皱缩
、
顶部坏死和果实木质化等症状，严重影响西番莲的生产安全
。EAPV、TeMV
和
CMV
引起的西番莲病毒病，至今尚无有效的防治手段，因此建立快速检测和筛查技术，是防控三种病毒为害的关键
。
[0003]与常规
PCR
相比，多重
PCR
技术拥有单个
PCR
的灵敏和特异性，又更加快捷
、
经济
、
增加了检测的通量，已应用于多种植物
、
动物病原检测中
。
反转录聚合酶链式反应
(ReverseTranscription
–
Polymerase chain reaction
，
RT
‑
PCR)
是
PCR
技术应用的一种，先将
RNA
转录成
cDNA
，再以
cDNA
为模板，在
DNA
聚合酶的作用下扩增合成目的片段，广泛应用于
RNA
病毒的检测中
。
经查，目前针对西番莲中以上三种病毒还未见建立多重
RT
‑
PCR
检测方法的报道
。

技术实现思路

[0004]本专利技术要解决的技术问题是提供快速
、
简便
、
经济且准确的西番莲三种
RNA
病毒的多重
RT
‑
PCR
引物组及其方法
。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：
[0006]同时检测西番莲三种
RNA
病毒的多重
RT
‑
PCR
引物组，包括三对
RT
‑
PCR
检测引物，它们分别针对
TeMV、EAPV
和
CMV
三种病毒，它们分别具有序列表
SEQ.ID.NO.1
至
SEQ.ID.NO.6
的碱基序列
。
[0007]含有上述引物组的同时检测西番莲三种
RNA
病毒的多重
RT
‑
PCR
检测试剂盒
。
[0008]上述同时检测西番莲三种
RNA
病毒的多重
RT
‑
PCR
检测试剂盒，包括以下试剂：阳性对照
、
阴性对照和引物组
。
[0009]阳性对照为含有
TeMV、EAPV
和
CMV
三种病毒的总核酸标准品，阴性对照为无病毒西番莲总核酸，引物组为预混的包含针对
TeMV、EAPV
和
CMV
三种病毒的多重
RT
‑
PCR
引物组，它们分别具有序列表
SEQ.ID.NO.1
至
SEQ.ID.NO.6
的碱基序列
。
[0010]利用上述引物组的同时检测西番莲三种
RNA
病毒的多重
RT
‑
PCR
检测方法
。
[0011]RT
‑
PCR
的反应体系为：
20
μ
l
反应体系中，含有2×
Rapid Taq Master Mix 10
μ
l
，
TeMV
上游引物和下游引物各1μ
l
，
EAPV
上游引物和下游引物各1μ
l
，
CMV
上游引物和下游引物各
1.5
μ
l
，模板1μ
l
，
ddH2O 2
μ
l
；
[0012]PCR
反应程序为：
95℃
预变性
3min
，
95℃
变性
15sec
，
55℃
退火
15sec
，
72℃
延伸
30sec
，
35
个循环；最后
72℃
延伸
5min。
[0013]针对三种常见西番莲病毒缺乏快速有效同时检测手段的问题，专利技术人根据其核苷酸保守区
CP(coat protein)
序列设计并合成了同时检测西番莲三种
RNA
病毒的多重
RT
‑
PCR
引物组，包括三对
RT
‑
PCR
检测引物，它们分别针对
TeMV、EAPV
和
CMV
三种病毒，它们分别具有序列表
SEQ.ID.NO.1
至
SEQ.ID.NO.6
的碱基序列
。
据此，专利技术人还对影响多重<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
同时检测西番莲三种
RNA
病毒的多重
RT
‑
PCR
引物组，其特征在于包括三对
RT
‑
PCR
检测引物，它们分别针对
TeMV、EAPV
和
CMV
三种病毒，它们分别具有序列表
SEQ.ID.NO.1
至
SEQ.ID.NO.6
的碱基序列
。2.
含有权利要求1所述引物组的同时检测西番莲三种
RNA
病毒的多重
RT
‑
PCR
检测试剂盒
。3.
根据权利要求2所述的同时检测西番莲三种
RNA
病毒的多重
RT
‑
PCR
检测试剂盒，其特征在于包括以下试剂：阳性对照
、
阴性对照和引物组
。4.
根据权利要求3所述的同时检测西番莲三种
RNA
病毒的多重
RT
‑
PCR
检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为含有
TeMV、EAPV
和
CMV
三种病毒的总核酸标准品，阴性对照为无病毒西番莲总核酸，引物组为预混的包含针对
TeMV、EAPV
和
CMV
三种病毒的多重
RT
‑
PCR
引物组，它们分别具有序列表
SEQ.ID.NO.1
至
SEQ.ID...

【专利技术属性】
技术研发人员：张莉娟，吴凤，韦璐阳，吴静娜，杨秀娟，蒋越华，吕丽兰，单彬，邓有展，时鹏涛，
申请(专利权)人：广西壮族自治区亚热带作物研究所广西亚热带农产品加工研究所，
类型：发明
国别省市：