一种检测穿山甲东阳病毒的制造技术

本发明专利技术公开了一种检测穿山甲东阳病毒的

【技术实现步骤摘要】
一种检测穿山甲东阳病毒的TaqMan荧光定量PCR引物组、试剂盒及方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种检测穿山甲东阳病毒的
TaqMan
荧光定量
PCR
引物组
、
试剂盒及方法
。

技术介绍

[0002]东阳病毒
(Dong Yang pangolin virus
，
DYPV)
是一种新型的包膜
RNA
瘟病毒，其具有高度可变的单链正义
RNA
基因组，包含一个大的开放阅读框
(ORF)
，编码一个长度约为
3900
个氨基酸的多蛋白
。
该病毒可能引发亚临床症状或引起一系列临床症状，包括急性腹泻
、
急性出血性综合征
、
急性致命性疾病等消耗性疾病典型病症
。
有研究显示，感染
DYPV
的穿山甲出现肝肺充血
、
皮肤病变
、
肝细胞的癞核
、
脾脏淋巴细胞固缩
、
肝板坏死和肾小球坏死等病理变化
。
虽然
DYPV
暂未对我国畜牧业及林业造成严重影响，相关研究及报道也较少，但应对其潜伏感染引起高度重视，避免
DYPV
呈现爆发性流行
、
危害动物健康造成严重损失
。
因此，建立一种灵敏
、
快速/>、
准确的方法来进一步对
DYPV
进行调查
、
诊断
、
预防是非常有必要的
。

技术实现思路

[0003]为了克服现有技术存在的缺陷，本专利技术提供了检测穿山甲东阳病毒的
TaqMan
荧光定量
PCR
引物组
、
试剂盒及方法，建立一种简便
、
高效
、
实用的
DNA
检测方法，该方法可用于
DYPV
快速检测，应用前景广阔
。
[0004]本专利技术的第一个目的是提供检测穿山甲东阳病毒的
TaqMan
荧光定量
PCR
引物组，包括一对引物
F、R
和探针
P
，所述的引物
F
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示，所述的引物
R
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.2
所示，所述的探针
P
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.3
所示，探针
P
的5’
端标记有荧光报告基团，3’
端标记有荧光淬灭基团
。
[0005]优选，所述的荧光报告基团为
FAM
，所述的荧光淬灭基团为
BHQ1。
[0006]本专利技术的第二个目的是提供一种含有所述的检测穿山甲东阳病毒的
TaqMan
荧光定量
PCR
引物组的试剂盒
。
[0007]优选，所述的试剂盒还包括：荧光定量
PCR
预混液2×
TaqMan Universal probe Mix、
阳性对照和阴性对照；所述的阳性对照为含有穿山甲东阳病毒的
5'UTR
基因的重组质粒，所述的阴性对照为
ddH2O。
[0008]本专利技术还提供所述的检测穿山甲东阳病毒的
TaqMan
荧光定量
PCR
引物组在制备用于检测穿山甲东阳病毒的试剂中的用途，所述的试剂用于检测来自于穿山甲的样本
。
[0009]本专利技术的第三个目的是提供一种非疾病诊断目的的检测穿山甲东阳病毒的
TaqMan
荧光定量
PCR
方法，包括以下步骤：
[0010]S1.
提取待检样品的
RNA
并反转录为
cDNA
；
[0011]S2.
利用所述的检测穿山甲东阳病毒的
TaqMan
荧光定量
PCR
引物组
、
以步骤
S1
获得
的
cDNA
为模板进行荧光定量
PCR
扩增；
[0012]S3.
反应结束后，根据扩增曲线情况判断待检样品中是否含有穿山甲东阳病毒；所述的判断的方法为：如果扩增曲线为典型荧光扩增曲线
(
有特异性扩增反应
)
，则待检样品中含有穿山甲东阳病毒；如果扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则待检样品中不含有穿山甲东阳病毒
。
[0013]优选，所述的步骤
S2
的荧光定量
PCR
扩增的反应体系为
20
μ
L
，包含：2×
Taq Man Universal probe Mix 10
μ
L、10
μ
M
的引物
F1.0
μ
L、10
μ
M
的引物
R1.0
μ
L、10
μ
M
的探针
P 0.4
μ
L、cDNA
模板
1.0
μ
L
，加
ddH2O
补足至
20
μ
L
；所述的荧光定量
PCR
扩增的反应程序为：预变性
95℃2min
，
40
个循环：变性
95℃15s、
退火
60℃40s
延伸，并在
60℃
收集荧光信号
。
[0014]本专利技术具有以下有益效果：
[0015]本专利技术以
DYPV
的
5'UTR
基因作为目标基因，该序列高度保守，
PCR
较易扩增，根据
TaqMan
实时荧光
PCR
的基本原理，针对
DYPV
的
5'UTR
区域为靶基因的特异性区域，设计2条特异性引物和1条探针，建立一种简便
、
高效
、
实用的
DNA
检测方法
。
该方法具有灵敏度高
、
特异性强
、
耗时短
、
高通量等优势
。
这些优势使得本专利技术开发的基于
TaqMan
荧光定量
PCR
检测方法方便用于实验室对
DYPV
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
检测穿山甲东阳病毒的
TaqMan
荧光定量
PCR
引物组，其特征在于，包括一对引物
F、R
和探针
P
，所述的引物
F
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示，所述的引物
R
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.2
所示，所述的探针
P
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.3
所示，探针
P
的5’
端标记有荧光报告基团，3’
端标记有荧光淬灭基团
。2.
根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述的荧光报告基团为
FAM
，所述的荧光淬灭基团为
BHQ1。3.
一种含有权利要求1所述的检测穿山甲东阳病毒的
TaqMan
荧光定量
PCR
引物组的试剂盒
。4.
根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括：荧光定量
PCR
预混液2×
TaqMan Universal probe Mix、
阳性对照和阴性对照；所述的阳性对照为含有穿山甲东阳病毒的
5'UTR
基因的重组质粒，所述的阴性对照为
ddH2O。5.
权利要求1所述的检测穿山甲东阳病毒的
TaqMan
荧光定量
PCR
引物组在制备用于检测穿山甲东阳病毒的试剂中的用途，所述的试剂用于检测来自于穿山甲的样本
。6.
一种非疾病诊断目的的检测穿山甲东阳病毒的
TaqMan
荧光定量
PCR
方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.
提取待检样品的
RNA<...

【专利技术属性】
技术研发人员：张立娜，刘桂红，刘昊，窦红亮，胡婷婷，
申请(专利权)人：广东生态工程职业学院，
类型：发明
国别省市：