一种利用耐热纳米笼状蛋白颗粒封装并递送外源蛋白的方法、体系和应用技术

本发明专利技术提供了一种利用耐热纳米笼状蛋白颗粒封装并递送外源蛋白的方法、体系和应用，涉及疫苗技术领域。本发明专利技术在外源蛋白C端添加一段定位肽(TP)，其中添加的TP可与对应的耐热纳米笼状蛋白的内部位点特异性结合，引导外源货物的封装，从而建立蛋白封装和递送系统。本发明专利技术利用所述系统封装和递送疫苗抗原，可显著提高抗原的稳定性和免疫原性，有助于保护疫苗抗原免受外界极端条件的损害，有效克服疫苗对冷链的依赖。同时，纳米颗粒较大的粒径极易被机体抗原递呈细胞吞噬，诱发机体更强的免疫反应。应。应。

【技术实现步骤摘要】
一种利用耐热纳米笼状蛋白颗粒封装并递送外源蛋白的方法、体系和应用


[0001]本专利技术属于疫苗
，具体涉及一种利用耐热纳米笼状蛋白颗粒封装并递送外源蛋白的方法、体系和应用。

技术介绍

[0002]传统疫苗抗原的主要成分为蛋白质，通常需要严格的储存条件以保持其免疫活性，意外暴露于环境压力(例如，光照或温度)可能会导致蛋白降解进一步诱发免疫原性丧失，亟需开发具有超高稳定性的载体用于封装和递送疫苗抗原。
[0003]区室化是所有细胞的基本特征。它允许细胞以受控和有序的方式分离和协调生理功能。存在不同的区室化机制，与原核生物最相关的是通过自组装的基于蛋白质的区室进行封装。一个普遍的例子是笼状蛋白质纳米区室，能够划分细菌和古菌中的特定反应、途径和过程。尽管其作为相对较新的生物工程工具，但纳米笼状蛋白表现出众多积极的特征，包括从24到42nm的严格隔室尺寸，原核表达系统中直接表达和折叠自组装，显著的物理稳健性，以及内部和外部的结合位点，均为理性遗传和分子操作奠定了基础。最近一项研究强调了纳米笼状蛋白在生物医学中的有用性，即铁蛋白作为药物递送方式在血管免疫靶向中的应用，这对于开发新型药物封装和递送方式具有重要意义。
[0004]尽管纳米笼状蛋白已经显示在药物递送方面具有重要的应用潜力，但开发具备超高热稳定性以及能够特异性封装外源性蛋白的蛋白笼递送系统具有挑战性。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种利用耐热纳米笼状蛋白颗粒封装并递送外源蛋白的方法、体系和应用，利用耐热纳米笼状蛋白颗粒封装外源蛋白可用于制备热稳定性纳米疫苗，并可显著提高疫苗的稳定性和免疫原性。
[0006]本专利技术提供了一种利用耐热纳米笼状蛋白颗粒封装并递送外源蛋白的方法，包括以下步骤：在外源蛋白的C端连接定位肽TP，得第一融合蛋白；
[0007]将所述第一融合蛋白融合进耐热纳米笼状蛋白颗粒的N端；
[0008]所述耐热纳米笼状蛋白颗粒的部分序列与定位肽TP特异性结合。
[0009]优选的，所述外源蛋白包括外源疫苗抗原。
[0010]优选的，所述定位肽TP富含丙氨酸、脯氨酸和甘氨酸残基。
[0011]优选的于，所述耐热纳米笼状蛋白颗粒包括超嗜热蛋白笼颗粒。
[0012]本专利技术还提供了利用上述方法构建得到的耐热纳米笼状蛋白颗粒封装系统。
[0013]本专利技术还提供了上述耐热纳米笼状蛋白颗粒封装系统的制备方法，包括以下步骤：利用表达系统对上述耐热纳米笼状蛋白颗粒封装系统进行蛋白质诱导表达，得所述耐热纳米笼状蛋白颗粒封装系统。
[0014]优选的，所述表达系统包括原核表达系统。
[0015]本专利技术还提供了上述耐热纳米笼状蛋白颗粒封装系统在制备热稳定性纳米疫苗中的应用。
[0016]本专利技术还提供了上述耐热纳米笼状蛋白颗粒封装系统在提高纳米疫苗免疫原性中的应用。
[0017]本专利技术还提供了一种利用耐热纳米笼状蛋白颗粒封装的纳米疫苗。
[0018]有益效果：本专利技术提供了一种利用耐热纳米笼状蛋白颗粒封装并递送外源蛋白的方法，在外源蛋白C端添加一段定位肽(TP)，其中添加的TP可与对应的耐热纳米笼状蛋白的内部位点特异性结合，引导外源货物的封装，从而建立蛋白封装和递送系统。
[0019]本专利技术利用所述系统封装和递送疫苗抗原，可显著提高抗原的稳定性和免疫原性，有助于保护疫苗抗原免受外界极端条件的损害，有效克服疫苗对冷链的依赖。同时，纳米颗粒较大的粒径极易被机体抗原递呈细胞吞噬，诱发机体更强的免疫反应。
附图说明
[0020]图1为Tm抗原封装和递送系统构建示意图；
[0021]图2为SDS
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PAGE/考马斯亮蓝染色纯度鉴定结果图；
[0022]图3为Tm和OVA
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TP
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Tm的TEM图；
[0023]图4为不同温度处理后Tm和OVA
‑
TP
‑
Tm的溶解度对比图；
[0024]图5为冻融前后Tm和OVA
‑
TP
‑
Tm的溶解度对比图；
[0025]图6为冻干重新溶解后Tm和OVA
‑
TP
‑
Tm的TEM图；
[0026]图7为冻干重新溶解后Tm和OVA
‑
TP
‑
Tm的溶解度对比图；
[0027]图8为不同处理后细胞内的相对荧光强度结果图；
[0028]图9为小鼠腹股沟淋巴结中荧光标记DCs细胞的百分比结果图；
[0029]图10为流式细胞术检测各组小鼠脾细胞中活化T细胞的百分比结果图；
[0030]图11为各组小鼠脾细胞中IFN
‑
γ的分泌水平统计结果图；
[0031]图12为各组小鼠的肿瘤体积动态监测曲线和免疫结束后小鼠的肿瘤湿重图。
具体实施方式
[0032]本专利技术提供了一种利用耐热纳米笼状蛋白颗粒封装并递送外源蛋白的方法，包括以下步骤：在外源蛋白的C端连接定位肽TP，得第一融合蛋白；
[0033]将所述第一融合蛋白融合进耐热纳米笼状蛋白颗粒的N端；
[0034]所述耐热纳米笼状蛋白颗粒的部分序列与定位肽TP特异性结合。
[0035]本专利技术首先在外源蛋白的C端连接定位肽TP，得第一融合蛋白，所述外源蛋白优选包括外源疫苗抗原。本专利技术对所述外源疫苗抗原的种类并没有特殊限定，实施例中以肿瘤模型抗原OVA(SEQ ID NO.1：GSIGAASMEFCFDVFKELKVHHANENIFYCPIAIMSALAMVYLGAKDSTRTQINKVVRFDKLPGFGDSIEAQCGTSVNVHSSLRDILNQITKPNDVYSFSLASRLYAEERYPILPEYLQCVKELYRGGLEPINFQTAADQARELINSWVESQTNGIIRNVLQPSSVDSQTAMVLVNAIVFKGLWEKAFKDEDTQAMPFRVTEQESKPVQMMYQIGLFRVASMASEKMKILELPFASGTMSMLVLLPDEVSGLEQLESIINFEKLTEWTSSNVMEERKIKVYLPRMKMEEKYNLTSVLMAMGITDVFSSSANLSGISSAESLKISQAVHAAHAEINEAGREVVGSAEAGVDAASVSEEFRADHPFLFCIKHIATNAVLFFGRCVS)为例进行说明，但是不能仅将其认定为本专利技术的全部保
护范围。本专利技术所述定位肽TP优选富含丙氨酸、脯氨酸和甘氨酸残基，并且通常包括特定的锚定序列，例如Gly
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Ser
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Leu单线态或双重态基序。该靶向基序通过构象拟合、疏水相互作用和盐桥，使得封装蛋白允许通过自然或合理融合的TP序列对天然或异源货物蛋白进行简单和特异性的封装。本专利技术对于所述定位肽TP的种类和序列同样没有特殊限定，只要能够本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用耐热纳米笼状蛋白颗粒封装并递送外源蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：在外源蛋白的C端连接定位肽TP，得第一融合蛋白；将所述第一融合蛋白融合进耐热纳米笼状蛋白颗粒的N端；所述耐热纳米笼状蛋白颗粒的部分序列与定位肽TP特异性结合。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述外源蛋白包括外源疫苗抗原。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述定位肽TP富含丙氨酸、脯氨酸和甘氨酸残基。4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述耐热纳米笼状蛋白颗粒包括超嗜热蛋白笼颗粒。5.利用权利要求1～4任一项所述方法构建...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈泽良，范首东，张劲松，张燚，
申请(专利权)人：东沃同泰凤城生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：