一种苦荞蛋白源制造技术

本发明专利技术属于食源性活性肽开发技术领域，具体涉及一种苦荞蛋白源

【技术实现步骤摘要】
一种苦荞蛋白源DPP
‑
IV抑制肽及其分离纯化方法


[0001]本专利技术属于食源性活性肽开发
，特别涉及一种苦荞蛋白源
DPP
‑
IV
抑制肽及其分离纯化方法
。

技术介绍

[0002]二肽基肽酶Ⅳ（
DPP
‑
IV
）是调控血糖的重要靶点
。
在人体内
DPP
‑
IV
具有降解胰高糖素样肽
‑1（
GLP
‑1）的作用，阻碍了
GLP
‑1发挥降低血糖的活性，从而使血糖失去控制
。
因此，
DPP
‑
IV
抑制剂的研发成为治疗Ⅱ型糖尿病的重要途径
。
食源性活性肽则具有公认的
DPP
‑
IV
抑制活性
。
但多肽复杂的制备工艺及筛选肽段的特异性的差异，限制了其工业化应用
。
[0003]多肽的分离纯化方法对其特异性肽段序列的筛选
、
结构解析以及工业化应用都至关重要
。
已有报道的多肽分离纯化方法包括超滤
、
凝胶色谱和高效液相色谱
。
目前使用最多的方法是超滤
。
超滤是一种通过不同膜孔径，筛分出小分子量为主多肽的膜过滤法
。
由于苦荞多肽的分子量＜
5kDa
的组分占近一半，例如，苦荞清蛋白来源的多肽分子量＜
5kDa
占
48.34%
；苦荞球蛋白来源的多肽分子量＜
5kDa
占
51.27%
，超滤法作为绿色物理技术广泛应用于苦荞肽的提取
。
然而，这一方法忽略了带电荷的苦荞多肽具有更强的
DPP
‑
IV
抑制活性的问题
。
因为多肽所带电荷不同极大的影响其与
DPP
‑
IV
酶的结合，而苦荞多肽中既有碱性又有酸性氨基酸，所以超滤法不适用于
DPP
‑
IV
抑制肽的分离纯化
。
[0004]现有技术
CN104738305A
公开了一种苦荞麦活性肽的制备方法，其分离纯化方式采用的是凝胶色谱层析，用磷酸盐缓冲液进行洗脱，且该生物活性肽具有抗菌
、
抗氧化和降胆固醇的功能，并被应用于饲料添加剂；而本申请的苦荞肽具有
DPP
‑
IV
的抑制功能，在治疗Ⅱ型糖尿病中具有潜质，并根据
DPP
‑
IV
抑制活性与电荷的关系，采用
DEAE
‑
52
阴离子交换柱获得了弱电性的
、
高
DPP
‑
IV
抑制活性的苦荞肽，即在分离纯化方法和多肽功能上均不同
。
[0005]本专利技术使用
DEAE
‑
52
阴离子交换层析分离出带电强弱不同的苦荞多肽，特别适用于分离中性或酸性组分
。DEAE
‑
52
是一种阴离子交换柱，其填料颗粒上带有正电荷
。
采用不同浓度的盐溶液洗脱可以分离带电物质，其中，中性物质（弱电荷组分）分离效率最高
。
我们研究发现，苦荞中
DPP
‑
IV
抑制肽集中在弱电荷组分
。
因此，
DEAE
‑
52
在分离苦荞
DPP
‑
IV
抑制肽具有很强的针对性，仅采用无盐洗脱液，即可分离有效组分，避免了高盐洗脱产物进一步脱盐处理的繁琐工艺，大大提升了纯化效率
。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术的目的是为了提高苦荞多肽的分离纯化效率，获得高效的
DPP
‑
IV
抑制肽，用于治疗Ⅱ型糖尿病
。
[0007]本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供一种苦荞蛋白源
DPP
‑
IV
抑制肽，所述抑制肽的氨基酸序列为：
LAGQS
，如
SEQ ID NO:1
所示
。
[0008]本专利技术还提供一种苦荞蛋白源
DPP
‑
IV
抑制肽，所述抑制肽的氨基酸序列为：
LREIDDADK
，如
SEQ ID NO:5
所示
。
[0009]本专利技术还提供上述两种抑菌肽或其复合物在
DPP
‑
IV
蛋白酶活性调控中的应用
。
[0010]本专利技术提供一种苦荞蛋白源
DPP
‑
IV
抑制肽的分离纯化方法，包括以下步骤：（1）苦荞蛋白制备：将苦荞粉和石油醚混合，获得脱脂苦荞粉，然后再通过
pH
调节
、
透析
、
除盐
、
干燥，获得苦荞蛋白
。
[0011]（2）苦荞蛋白酶解：采用
4%
复合酶对
pH7
，
2%
苦荞蛋白进行酶解；所述复合酶包括：中性酶
、
风味酶
、
木瓜蛋白酶
、
碱性蛋白酶
、
胃蛋白酶
、
胰蛋白酶
。
[0012]（3）苦荞肽复合物提取：将（2）反应后溶液煮沸，灭活蛋白酶，离心收集上清，获得苦荞肽粗提物
。
[0013]（4）苦荞肽分离纯化：采用
DEAE
‑
52
阴离子柱和液相色谱分离纯化中性苦荞肽组分；所述
DEAE
‑
52
阴离子柱利用洗脱液选择中性多肽组分；所述洗脱液为无盐洗脱液；所述中性肽组分为苦荞蛋白源的
DPP
‑
IV
抑制肽
。
[0014]（5）苦荞肽鉴定：采用
NanoLC
‑
MS/MS
对苦荞
DPP
‑
IV
抑制肽进行测序
、
分析
。
[0015]具体的苦荞蛋白源
DPP
‑
IV
抑制肽的分离纯化方法步骤为：（1）苦荞蛋白制备：将苦荞粉与石油醚按1：5料液比混合，室温搅拌
1 h
（
600 rpm
）
。
经减压抽滤，并干燥，获得脱脂苦荞粉
。
脱脂苦荞粉按照
10%本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种苦荞蛋白源
DPP
‑
IV
抑制肽，其特征在于，所述抑制肽的氨基酸序列为：
LAGQS
，如
SEQ ID NO:1
所示
。2.
一种苦荞蛋白源
DPP
‑
IV
抑制肽，其特征在于，所述抑制肽的氨基酸序列为：
LREIDDADK
，如
SEQ ID NO:5
所示
。3.
一种苦荞蛋白源
DPP
‑
IV
抑制肽的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）苦荞蛋白制备：将苦荞粉和石油醚混合，获得脱脂苦荞粉，然后再通过
pH
调节
、
透析
、
除盐
、
干燥，获得苦荞蛋白；（2）苦荞蛋白酶解：采用
4%
复合酶对
pH7
，
2%
苦荞蛋白进行酶解；（3）苦荞肽复合物提取：将（2）反应后溶液煮沸，灭活蛋白酶，离心收集上清，获得苦荞肽粗提物；（4）苦荞肽分离纯化：采用
DEAE
‑
52
阴离子柱和液相色谱分离纯化中性
、
高
DPP
‑
IV
抑制活性的苦荞肽组分；（5）苦荞肽鉴定：采用
NanoLC
‑
MS/MS
对苦荞
DPP

【专利技术属性】
技术研发人员：仇菊，吴伟菁，郭子聪，吴兰兰，王丽娟，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：