一种用于奶牛精子分离的荧光染色方法技术

本发明专利技术涉及一种用于奶牛精子分离的荧光染色方法，包括奶牛精液在染色前通过离心去除部分精浆，将去除部分精浆的精子按一定比例与荧光染料混合进行染色。这种新型荧光染色方法具有染色效果好、染色后Ｘ／Ｙ精子荧光强度差别大、精子易于分选分离等优点，不但提高了精子分离效果、效率，而且提高了种公牛的利用率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞及生殖生物
适用于利用流式细胞仪进行奶牛精子分离、生产性控冻精。
技术介绍
目前，基于流式细胞仪的精子分离是奶牛或肉牛的性别控制的有效技术和手段， 而精子的荧光染色是分离过程的必要和关键步骤。哺乳动物性别控制是人们一直以来感兴 趣并进行了大量、广泛研究的课题，经过长期的研究现已证明，基于流式细胞仪的精子分离 是最成功并且最具实用性的性别控制技术。这项技术在多种哺乳动物获得成功，在包括中 国在内的多个国家进行了推广使用，在奶牛的性别控制中已经或正在发挥着巨大的作用。 使用荧光染料对精子进行染色，是利用流式细胞仪分离牛X/Y精子的关键性步骤，染色效 果的好坏不仅极大地影响精子分离效果、效率，而且决定了种公牛的利用率。现在包括该技 术的发源地美国在内的其它国家利用该技术种公牛的利用率仅为30%左右。 我们的研究证实原精里的精浆对染色有很大的影响，适当去除部分精浆能够十分 有效地提高染色效果。生产实践中使用去除部分精浆的染色方法不但可以提高分离效果、 分离速度，并且使种公牛的利用率从30%提高到90%以上。文献检索和资料查询未发现国 内外有相同或类似的任何技术报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，该方法提高了精子 的分离效果和分离速度。本专利技术的用于奶牛精子分离的荧光染色方法，包括以下步骤 (1)通过离心去除奶牛精液中的精浆； (2)牛精子的荧光染色将去除部分精浆的奶牛精子按一定比例与荧光染料混 合，34。C水浴45分钟; (3)通过流式细胞仪分离染色的奶牛精子。分离操作过程如下 a)分离机型号为SX-Moflo或XDP，产地为美国； b)分离模式选择Purify 1 ; c)把样品置于加样站中，打开加样器上的压力和样品开关，按boost使样品从tip 流出，调整样品压力使trigger rate保持在30000以下； d)精细调整图形达到最清晰，一旦开始分离不可以移动影响dropdelay的旋钮； e) Summit4. 0软件上选择分离，R2选取X区域； f)约15分钟摇动收集管，保证精子活力，每管样品分离时间不超过l小时，并记录 机器状态和分离情况。 所述去除奶牛精液中的精浆的步骤可以是将奶牛原精直接离心后吸弃上层的精 浆或者先用缓冲液稀释奶牛原精，然后进行离心并吸弃上层的精浆。 所述稀释奶牛原精的步骤包括将4亿奶牛原精添加到15ml离心管中，用缓冲液至 3. 0ml， 1600rpm离心5分钟，分别吸弃0. 5ml， 1ml， 1. 5ml和2ml上清液。 所述缓冲液组成为 <table>table see original document page 4</column></row><table>所述荧光染料是Hochest33342(产地美国)，浓度5mg/ml (摩尔浓度8. 898rnM)。 所述奶牛精子与荧光染料的比例为1亿个精子4 5微升荧光染料。 本专利技术的新型荧光染色方法的优点是由于奶牛精液在染色前去掉部分精浆，减少了精浆及其所包含的其它成份对染色的干扰，提高了荧光染料对精子的染色效果，染色后X/Y精子荧光强度差别大，精子易于分选分离等优点，同时，能够一定程度降低荧光染料的使用量，提高分离精子的质量。附图说明 以下附图仅旨在于对本专利技术做示意性说明和解释，并不限定本专利技术的范围。其中， 图la是显示1600rpm离心5分钟，分别吸弃0. 5ml上清液，再进行染色和分离得 到的分离效果图；横坐标表示荧光强度，纵坐标表示荧光强度； 图lb是显示1600rpm离心5分钟，分别吸弃0. 5ml上清液，再进行染色和分离得 到的染色效果图；横坐标表示荧光强度，纵坐标表示精子细胞数； 图2a是显示1600rpm离心5分钟，分别吸弃1ml上清液，再进行染色和分离得到 的分离效果图；横坐标表示荧光强度，纵坐标表示荧光强度； 图2b是显示1600rpm离心5分钟，分别吸弃1ml上清液，再进行染色和分离得到 的染色效果图；横坐标表示荧光强度，纵坐标表示精子细胞数； 图3a是显示1600rpm离心5分钟，分别吸弃1. 5ml上清液，再进行染色和分离得 到的分离效果图；横坐标表示荧光强度，纵坐标表示荧光强度； 图3b是显示1600rpm离心5分钟，分别吸弃1. 5ml上清液，再进行染色和分离得 到的染色效果图；横坐标表示荧光强度，纵坐标表示精子细胞数； 图4a是显示1600rpm离心5分钟，分别吸弃2ml上清液，再进行染色和分离得到 的分离效果图；横坐标表示荧光强度，纵坐标表示荧光强度； 图4b是显示1600rpm离心5分钟，分别吸弃2ml上清液，再进行染色和分离得到 的染色效果图；横坐标表示荧光强度，纵坐标表示精子细胞数； 图5a是显示1600rpm离心5分钟，分别吸弃0. 5ml上清液，再进行染色和分离得 到的分离效果图；横坐标表示荧光强度，纵坐标表示荧光强度； 图5b是显示1600rpm离心5分钟，分别吸弃0. 5ml上清液，再进行染色和分离得 到的分离速度比较图；横坐标表示荧光强度，纵坐标表示荧光强度； 图5c是显示1600rpm离心5分钟，分别吸弃0. 5ml上清液，再进行染色和分离得 到的染色效果图；横坐标表示荧光强度，纵坐标表示精子细胞数； 图6a是显示1600rpm离心5分钟，分别吸弃1ml上清液，再进行染色和分离得到 的分离效果图；横坐标表示荧光强度，纵坐标表示荧光强度； 图6b是显示1600rpm离心5分钟，分别吸弃1ml上清液，再进行染色和分离得到 的分离速度比较图；横坐标表示荧光强度，纵坐标表示荧光强度； 图6c是显示1600rpm离心5分钟，分别吸弃1ml上清液，再进行染色和分离得到 的染色效果图；横坐标表示荧光强度，纵坐标表示精子细胞数； 图7a是显示1600rpm离心5分钟，分别吸弃1. 5ml上清液，再进行染色和分离得 到的分离效果图；横坐标表示荧光强度，纵坐标表示荧光强度； 图7b是显示1600rpm离心5分钟，分别吸弃1. 5ml上清液，再进行染色和分离得 到的分离速度比较图；横坐标表示荧光强度，纵坐标表示荧光强度； 图7c是显示1600rpm离心5分钟，分别吸弃1. 5ml上清液，再进行染色和分离得 到的染色效果图；横坐标表示荧光强度，纵坐标表示精子细胞数； 图8a是显示1600rpm离心5分钟，分别吸弃2ml上清液，再进行染色和分离得到 的分离效果图；横坐标表示荧光强度，纵坐标表示荧光强度； 图8b是显示1600rpm离心5分钟，分别吸弃2ml上清液，再进行染色和分离得到 的分离速度比较图；横坐标表示荧光强度，纵坐标表示荧光强度； 图8c是显示1600rpm离心5分钟，分别吸弃2ml上清液，再进行染色和分离得到 的染色效果图。横坐标表示荧光强度，纵坐标表示精子细胞数。具体实施例方式为了对本专利技术的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现对照附图说明本专利技术的具体实施方式。 实施例1 : 材料 1.4亿奶牛原精(牛号11105825，原精浓度7. 3亿/ml) 2.缓冲液组成HEPES，分子式<:61112^045，浓度9. 52X 10—3g/ml，摩尔浓度40. OOm本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于奶牛精子分离的荧光染色方法，包括以下步骤：　　（１）通过离心去除奶牛精液中的精浆；　　（２）奶牛精子的荧光染色：将去除部分精浆的牛精子按一定比例与荧光染料混合，３４℃水浴４５分钟；　　（３）通过流式细胞仪分离染色的牛精子。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周文忠，李喜和，王建国，钱松晋，
申请(专利权)人：内蒙古蒙牛繁育生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：15[中国|内蒙]