一种用于细胞捕获、荧光染色的微流控芯片制造技术

本实用新型专利技术提供了一种用于细胞捕获、荧光染色的微流控芯片，包括基底和设于基底上的细胞流道，基底上设有样本进口和废液出口，细胞流道的一端为细胞入口，细胞流道的另一端为细胞出口，细胞入口与样本进口相连，细胞出口与废液出口相连；细胞入口处还连接有染色液通道，染色液通道的另一端设有染色液入口；细胞流道由若干并排布置的微通道依次首尾相连而成；微通道内设有细胞捕获装置。本实用新型专利技术的微流控芯片捕获效率高，对细胞损伤小，可以实现目标细胞的富集、捕获和染色一体化，减小人为干扰，增加结果的灵敏性和可靠性。本实用新型专利技术的微流控芯片无需复杂工艺，通过常规方法即可制备得到，成本低，具有很强的实用性。

【技术实现步骤摘要】
一种用于细胞捕获、荧光染色的微流控芯片
本技术涉及微流控芯片的
，具体地说是一种用于细胞捕获、荧光染色的微流控芯片。
技术介绍
微流控芯片技术是把生物、化学、医学分析过程的样本制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程；其是生命科学、化学科学与信息科学信号检测和处理方法研究的重要技术平台。近年来，微流控芯片凭借其通道尺寸(10～100um)与单个细胞直径(10～20um)大小相近，便于对细胞进行操作，反应更迅速高效；微流控芯片形成的相对封闭环境，更接近生理状态下细胞的生存环境；微流控芯片与多个操作单元灵活组合，使得细胞进样、培养、捕获、裂解和分离检测等过程集于一块芯片即可完成，操作更加简便且无需专业技术；芯片为平板式几何构型，更方便进行观察等特性，使得微流控芯片在细胞生物学研究，如细胞捕获、筛分、富集、计数、培养等方面的应用越来越广(姚琳,白亮,吴亮其,等.微流控芯片技术在细胞生物学研究中的应用进展[J].中国细胞生物学学报,2011,33(11):1254-66.)。微流控芯片技术在细胞分离应用越来越广，基于不同细胞种群间固有特性见的差异，在微流控芯片中实现细胞的分离，诸如通过细胞的粒径尺寸间的差异实现对细胞的筛选分离，通过细胞表面的特异性抗体来特异性结合磁珠实现对细胞的正向富集或负向筛选；且微流控芯片技术在细胞操作、分离富集应用也展现出其独特的优势：试剂样本消耗少，反应迅速高效、节省时间，灵敏度、分辨率高，功能集成性强可适用于多种检测，可实现自动化操作避免人为操作间的差异性，相对封闭空间避免交叉性污染(BhagatAAS,BowH,HouHW,etal.Microfluidicsforcellseparation[J].Medical&biologicalengineering&computing,2010,48(10):999-1014.)。循环肿瘤细胞，(CirculatingTumorCell，简称CTC)，是指由原发肿瘤或继发肿瘤自发进入或诊断操作带入外周血的肿瘤细胞，具有高活力和转移潜能的CTC可以在循环系统中存活，并在合适的环境中增殖，导致肿瘤的复发和转移。CTC的活检分析可用以早期诊断、风险分级、疗效评估和肺癌复发的早期检查。但是外周血中的CTC含量极低，肿瘤转移患者每毫升全血中仅有1～10个CTC，因此对CTC细胞进行准确的捕获和计数具有重要的意义。近年来用于捕获CTC的方法有：利用外力场如磁场、电场、流体场等，并且基于细胞间的物理特性差异如大小、密度等对血液样本进行反向筛选，去除大部分的白细胞，保证7.5ml的血液样本中含有<10,000个细胞。但是考虑到CTC种群的异质性，且富集捕获的血液样本中依然含有不少的白细胞，因此会采用免疫荧光染色对CTC鉴定、确认(HongB,ZuY.Detectingcirculatingtumorcells:currentchallengesandnewtrends[J].Theranostics,2013,3(6):377-394)。基于免疫荧光染色对富集捕获的血液样本进行肿瘤细胞特异性蛋白荧光标记，已成为常用的CTC检测手段(ZhengS,LinHK,LuB,etal.3Dmicrofilterdeviceforviablecirculatingtumorcell(CTC)enrichmentfromblood[J].Biomedicalmicrodevices,2011,13(1):203-213)。比如通过免疫荧光染色方法标记细胞角蛋白抗原(cytokeratin，CK)，来识别上皮循环肿瘤细胞，即CTC呈CK阳性、CD45阴性、DAPI阳性；而白细胞为CD45阳性、CK阴性、DAPI阳性(LinHK,ZhengS,WilliamsAJ,etal.Portablefilter-basedmicrodevicefordetectionandcharacterizationofcirculatingtumorcells[J].ClinicalCancerResearch,2010,16(20):5011-5018)。最后可直接进行荧光镜检扫描，对免疫荧光染色后的CTC进行分析和计数。其中，细胞免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术，其是基于抗原抗体反应的原理，将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞膜或胞内的相应抗原(或抗体)，利用荧光显微镜镜检观察荧光所在的细胞，从而对细胞进行定性或定量测定。按照样本特性，可分为两类：(1)用于荧光标记固定在玻片上的细胞，如细胞爬片或直接涂片，(2)细胞悬液免疫荧光分析，通过流式细胞仪进行检测分析。对富集捕获后的含有CTC的血液样本进行免疫荧光染色处理，根据细胞物理状态可分为：细胞固定在玻片后进行荧光染色即固定染色，和直接在细胞悬液中进行荧光染色即液体染色。无论是那种染色方法，细胞荧光染色一般包括如下步骤：PFA或乙醇固定、细胞透膜、细胞封闭、一抗孵育、避光环境下二抗孵育、染核及每步操作之间的PBS反复清洗等(WellerP,NelI,HassenkampP,etal.Detectionofcirculatingtumorcellsubpopulationsinpatientswithheadandnecksquamouscellcarcinoma(HNSCC)[J].PloSone,2014,9(12):e113706)。然而，在玻片上进行固体染色一般需要在多聚赖氨酸包被的载体表面进行操作，对操作人员的实验技能有一定的要求。并且由于以上每步操作之间都需要对玻片进行反复的清洗处理，容易造成玻片上细胞的丢失，另外处理过程中玻片上的细胞暴露于空气中，也容易造成污染。而液体染色需要通过流式细胞仪进行检测，成本较高，而且至少需要10次以上的离心操作，不仅耗费了较长的时间和人力，并且在弃去上清的过程中也容易造成细胞的损失。综上所述，现有的细胞捕获、染色方法存在以下问题：样本经过细胞捕获后，需要人工操作进行细胞染色，不仅操作步骤繁琐，而且需要操作人员具有较强的实验技能，人工操作带来的误差较大，影响测定结果的准确性。并且对于微流控芯片捕获目标细胞来说，由于捕获目标细胞较大，流道容易堵塞造成目标细胞破裂，或者细胞逃逸，造成捕获效率低。
技术实现思路
本技术的主要目的是针对现有技术存在的不足提供一种用于细胞捕获、荧光染色的微流控芯片，以实现目标细胞的富集、捕获和染色一体化、自动化，减小人为干扰，并且捕获效率高。本技术是通过如下技术方案实现的：一种用于细胞捕获、荧光染色的微流控芯片，所述微流控芯片包括基底和设于基底上的细胞流道，所述基底上设有样本进口和废液出口，所述细胞流道的一端为细胞入口，细胞流道的另一端为细胞出口，所述细胞入口与样本进口相连，所述细胞出口与废液出口相连；所述细胞入口处还连接有染色液通道，所述染色液通道的另一端设有染色液入口；所述细胞流道由若干并排布置的微通道依次首尾相连而成；所述微通道内设有细胞捕获装置。优选的，所述细胞捕获装置为沿微通道头部至尾部方向设本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于细胞捕获、荧光染色的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片包括基底和设于基底上的细胞流道，所述基底上设有样本进口和废液出口，所述细胞流道的一端为细胞入口，细胞流道的另一端为细胞出口，所述细胞入口与样本进口相连，所述细胞出口与废液出口相连；所述细胞入口处还连接有染色液通道，所述染色液通道的另一端设有染色液入口；所述细胞流道由若干并排布置的微通道依次首尾相连而成；所述微通道内设有细胞捕获装置。

【技术特征摘要】
1.一种用于细胞捕获、荧光染色的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片包括基底和设于基底上的细胞流道，所述基底上设有样本进口和废液出口，所述细胞流道的一端为细胞入口，细胞流道的另一端为细胞出口，所述细胞入口与样本进口相连，所述细胞出口与废液出口相连；所述细胞入口处还连接有染色液通道，所述染色液通道的另一端设有染色液入口；所述细胞流道由若干并排布置的微通道依次首尾相连而成；所述微通道内设有细胞捕获装置。2.根据权利要求1所述的用于细胞捕获、荧光染色的微流控芯片，其特征在于：所述细胞捕获装置为沿微通道头部至尾部方向设置的微柱排，所述微柱排由若干呈线型分布的微柱组成，相邻的微柱间留有狭缝，每个微柱的靠近细胞入口一侧端面的直径不大于靠近细胞出口一侧端面的直径。3.根据权利要求2所述的用于细胞捕获、荧光染色的微流控芯片，其特征在于：所述微柱的截面为凸字形。4.根据权利要求2所述的用于细胞捕获、荧光染色的微流控芯片，其特征在于：所述微柱排沿微通道的头部至尾部方向，一端与微通道头部相接，另一端与微通道尾部之间留有开口。5.根据权利要求2所述的用于细胞捕获、荧光染色的微流控芯片，其特征在于：所述微柱排沿微通道的头部至尾部方向，与细胞入口一侧的侧壁距离逐渐减小。6.根据权利要求2所述的用于细胞捕获、荧光染色的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片还包括设于基底上的加强捕获流道，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：李鹏鑫，张一桐，张祥林，于丹，
申请(专利权)人：上海美吉逾华生物医药科技有限公司，
类型：新型
国别省市：上海,31