载卵母细胞制造技术

本发明专利技术涉及卵母细胞

【技术实现步骤摘要】
载卵母细胞/胚胎水凝胶微球的制备及玻璃化保存方法


[0001]本专利技术涉及卵母细胞
/
胚胎玻璃化冷冻
，尤其是涉及载卵母细胞
/
胚胎水凝胶微球的制备及玻璃化保存方法
。

技术介绍

[0002]卵母细胞
/
胚胎冷冻保存不仅可用于人类的生育力保存，还可为保护物种资源和拯救濒危物种提供技术保障，在基础研究
、
遗传保存模型的应用和临床应用中都具有重要作用
。
卵母细胞
/
胚胎冷冻保存技术通常分为慢速冷冻和玻璃化冷冻
。
慢速冷冻是将经过预处理的卵母细胞
/
胚胎进行程序降温，降温过程中冰晶的形成会对细胞造成损伤，导致冻存效果不理想，目前已被玻璃化冷冻技术取代
。
玻璃化是指冷冻前对细胞进行高浓度的低温保护剂
(Cryoprotective agents
，
CPA)
加载，然后以极高的冷却速率将液态快速过渡到玻璃状阶段，此阶段无冰晶产生，减少了胞内冰损伤
。
[0003]目前临床操作中常用的玻璃化冷冻技术仍是
Kuwayama
等提出的
Cryotop
法
。
尽管卵母细胞
/
胚胎冷冻复温后的存活率高达
90
‑
97
％，但使用的高浓度保护剂会对细胞产生毒性作用，造成卵母细胞
/
胚胎的
DNA
损伤使其发育能力减退
。
在平衡阶段以及升温过程中细胞内外过快的渗透压变化极易造成细胞的渗透损伤，也可能会导致卵母细胞萎缩变形，从而影响细胞的冻后存活率与发育率
。
除此之外，
CPA
与卵母细胞
/
胚胎的接触会引起细胞内钙离子增加，从而诱发皮质颗粒提前发生胞吐作用，导致卵母细胞透明带变硬，影响精子的穿透和受精
。
因此，需要新型的卵母细胞
/
胚胎玻璃化保存方法，以提高细胞冻后发育能力
。
[0004]水凝胶一种是由亲水性聚合物通过共价键或分子间作用力相互作用组成的三维网状结构物质，可以吸收大量的水或生物液体，且具有良好的生物相容性
。
水凝胶中的水可以分为三类：自由水
、
中间水和结合水，其中结合水在
‑
100℃
以下时仍能保持液态和流动性
。
因水凝胶特殊的结构和化学组成，其具有一定的抑冰能力
。
基于此种特殊性质，水凝胶作为细胞载体的冷冻保存研究引起了相关领域研究人员的极大兴趣
。Sarbani
等使用蚕丝
、
卡拉胶和明胶制备的混合水凝胶封装成骨细胞冷冻保存，复温后的细胞仍保持较高的分化和增殖能力
。Paweena
等研究了生物可降解的纤维蛋白原水凝胶包裹猫卵巢组织对其抗冷冻能力的影响，冻后卵巢皮质中的卵泡的形态和数量均高于未包封组
。
这些水凝胶封装细胞或组织进行冷冻保存研究已在低温保存领域逐渐兴起，然而，目前还没有任何报道水凝胶应用于包封卵母细胞
。
[0005]海藻酸钠是由褐藻或细菌产生的一种多糖的统称，能在毫摩尔浓度的钙或其他二价阳离子作用下形成稳定的水凝胶
。
这种胶化特性可在生理条件下包裹住细胞，并使细胞在整个基质中均匀分布
。
海藻酸钠水凝胶独特的三维网络结构具有限制冰晶生长的作用，使用海藻酸钠水凝胶包封细胞或组织进行低温保存，可以提高细胞或组织复温后的存活率和发育能力
。
[0006]海藻酸钠水凝胶包封细胞用于低温保存时，要求载细胞微球具有良好的生物相容性
、
均匀性
、
耐冻性
。
在低温保存过程中，较差的均匀度或较为脆弱的水凝胶外壳可能会对
CPA
渗透载细胞水凝胶微球的过程产生影响，从而导致
CPA
加载的效率降低；在投入液氮后，不均匀的水凝胶外壳在热应力的作用下，可能会在的薄弱部位形成裂纹，从而对细胞造成破坏，影响细胞的冻存效果
。
因此，在使用海藻酸钠水凝胶微球包封细胞时，包封材料
、
包封方法以及外壳形状尺寸等问题还待解决
。
[0007]目前，海藻酸钠水凝胶微球的制备方法包括手动制备以及电气设备辅助下的自动化制备
。
其中，手动制备通常是将含有海藻酸钠和细胞的混合溶液液滴置于网状物上倒置在氯化钙溶液上方，然后快速摇动或轻敲，使液滴落入交联浴；或者将含有海藻酸钠和细胞的混合溶液从移液管末端直接滴入交联浴中从而生成微球
。
虽然这种方法不需要使用任何仪器，但通过网格抖落液滴，或者移液枪吸取含细胞的海藻酸钠溶液的操作对液滴的液体量有一定要求，通常最小液体量需
2.5
μ
L
，人工操作无法精确控制生成的水凝胶微球形态和大小，导致微球大小过大或者过小，尺寸分布不均匀，这些因素可能会影响细胞封装冻存的效果和冻后存活发育情况
。
海藻酸钠水凝胶微球的电气自动化制备包括同轴气流法及静电喷雾法等
。
同轴气流法是使用同轴气流将出口处针尖上的液滴滴入交联浴中，可以产生最小
400
μ
m
左右的微球，其粒度分布通常会较大
。
静电喷雾法的液滴生成过程与同轴气流法类似，静电喷雾法可以生产小于
200
μ
m
，尺寸分布较小的微球
。
虽然这些自动化方法可以生成粒径较均匀的水凝胶微球，但这些电气设备在使用过程中可能会对细胞造成一定的损害，因此需要研究开发既操作温和，又可以稳定且均匀生成载细胞水凝胶微球的方法
。

技术实现思路

[0008]为了解决上述问题，本专利技术的目的是提供载卵母细胞
/
胚胎水凝胶微球的制备及玻璃化保存方法
。
本专利技术应用的微流控芯片可稳定生成具有高分散性和均匀性的载卵母细胞海藻酸钠微球，微球空包率和卵母细胞丢失率较低，且卵母细胞的存活率和后期发育情况均良好；卵母细胞玻璃化冷冻保存技术，可有效降低保护剂浓度与加载时长，减少对细胞的毒性作用和渗透损伤，提高卵母细胞的存活率和发育率
。
[0009]本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0010]本专利技术的第一个目的是提供一种载卵母细胞
/
胚胎水凝胶微球的制备方法，包括以下步骤：
[0011](S1)
将卵母细胞分散于海藻酸钠溶液中，得到含卵母细胞的海藻酸钠溶液；
[0012](S2)
将步骤
(S1)
得到的含卵母细胞的海藻酸钠溶液
、
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种载卵母细胞
/
胚胎水凝胶微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(S1)
将卵母细胞分散于海藻酸钠溶液中，得到含卵母细胞的海藻酸钠溶液；
(S2)
将步骤
(S1)
得到的含卵母细胞的海藻酸钠溶液
、
矿物油
、
油乳化剂泵送至微流控芯片中，含卵母细胞的海藻酸钠溶液首先与矿物油形成第一液滴，第一液滴与油乳化剂混合后，进一步交联形成载卵母细胞
/
胚胎水凝胶微球
。2.
根据权利要求1所述的一种载卵母细胞
/
胚胎水凝胶微球的制备方法，其特征在于，步骤
(S1)
中，海藻酸钠溶液的质量浓度为
0.5
％～
1.5
％；卵母细胞与海藻酸钠溶液的用量比为
30
～
35
颗：
800
μ
L。3.
根据权利要求1所述的一种载卵母细胞
/
胚胎水凝胶微球的制备方法，其特征在于，步骤
(S2)
中，所述微流控芯片由上至下分别为依次连接的设置有出口和入口的顶层
、
分布层
、
通道层和底层；所述通道层为三通道结构，所述三通道结构包括含卵母细胞的海藻酸钠溶液与矿物油交汇的第一通道
、
第一液滴与油乳化剂交汇的第二通道，以及，第一液滴与油乳化剂进行交联的
S
型交联通道
。4.
根据权利要求3所述的一种载卵母细胞
/
胚胎水凝胶微球的制备方法，其特征在于，所述第一通道分别与含卵母细胞的海藻酸钠溶液的入口
、
矿物油的入口以及第二通道的入口相连接；含卵母细胞的海藻酸钠溶液与矿物油交汇处靠近第二通道的入口处的一侧设置有喉部；所述第二通道分别与第一通道的出口
、
油乳化剂的入口和
S
型交联通道的入口相连接；所述
S
型交联通道的出口与顶层的出口相连接
。5.
根据权利要求1所述的一种载卵母细胞
/
胚胎水凝胶微球的制备方法，其特征在于，步骤
(S2)
中，油乳化剂为无水氯化钙
、
矿物油和司盘
80
的混合物；含...

【专利技术属性】
技术研发人员：周新丽，张宇琪，林春燕，
申请(专利权)人：上海理工大学，
类型：发明
国别省市：