催化粘康酸生成己二酸的烯酸还原酶的突变体蛋白及应用制造技术

本发明专利技术涉及催化粘康酸生成己二酸的烯酸还原酶的突变体蛋白，其通过计算设计和定点突变改造获得，具有较高的酶活力，其酶活力与野生型烯酸还原酶相比获得了大幅度的提高；将该烯酸还原酶的突变体蛋白应用于催化粘康酸生成己二酸具有较高的催化效率，可实现对于粘康酸到己二酸的高效转化；本发明专利技术以烯酸还原酶的突变体蛋白为催化剂，酶法催化粘康酸生成己二酸，大幅度提高了己二酸的产量

【技术实现步骤摘要】
催化粘康酸生成己二酸的烯酸还原酶的突变体蛋白及应用


[0001]本专利技术属于酶的理性设计改造和生物催化应用
，涉及一种催化粘康酸生成己二酸的烯酸还原酶的突变体蛋白及其应用
。

技术介绍

[0002]己二酸含有6个碳的二元羧酸，广泛应用于生产尼龙
6.6、
工程塑料和可降解塑料
PBAT
等
。
截止至
2020
年
12
月底，全球己二酸总产能约
490.8
万吨左右
。
目前生产己二酸普遍还是通过石油化工路线，在合成过程中会产生大量的
N2O
，如硝酸催化
KA
油
(
环己醇
/
环己酮混合物
)
的氧化进行化学合成，其造成的温室气候影响比
CO2高
298
倍
。
而使用绿色可再生原料生产可以生物己二酸有效地降低其带来的环境污染
。
[0003]目前生物法合成己二酸途径主要有：
i)
全生物合成：已经证明可行的方法有反向己二酸降解途径
、
β
‑
氧化或逆
β
‑
氧化与
ω
‑
氧化途径结合
、2
‑
氧代庚二酸途径；
ii)
生物合成己二酸前体并化学转化：研究较多是先将可再生生物质转化为顺式，顺式
‑/>粘康酸或葡萄糖酸，之后通过化学法生成己二酸
。1994
年，弗罗斯特等人首次报道以葡萄糖为碳源合成粘康酸的半生物合成方法，在摇瓶和生物反应器中分别产生约
2.4g/L
和
38.6g/L
的粘康酸
。
已有研究报道了5种来源的烯醇还原酶
(ERs)
在大肠杆菌中表达后具有催化粘康酸
(
顺式，顺式
)
到己二酸的活性，其中来自凝结芽孢杆菌的烯醇还原酶
(Enoate reductases from B.coagulans)
具有最高的活性，在
0.7mM
粘康酸
(
顺式，顺式
)
添加下进行的全细胞生物转化实验显示，培养
24h
后转化率为
94.3
％，然而其活性仍处于较低水平
。
最近孙婧等人通过构建基于工程大肠杆菌的共培养系统，以葡萄糖为碳源并在微需氧条件下，在
72
小时内己二酸产量达到
27.6
±
1.3mg/L(0.005g/g
碳源
)。
如此看来通过粘康酸合成己二酸途径生产生物己二酸成为了可能，但该代谢通路中转化粘康酸至己二酸的关键酶活性较低的问题成为了限制该途径的重要因素
。
因此需要针对该反应研究开发一种高催化活性的烯酸还原酶
。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是针对现有的烯酸还原酶酶在以粘康酸为底物的条件下酶活较低的问题，提供一种催化粘康酸生成己二酸的烯酸还原酶的突变体蛋白，该突变体蛋白具有较高的酶活力，可实现对于粘康酸到己二酸的高效转化
。
[0005]为此，本专利技术第一方面提供了一种影响烯酸还原酶催化粘康酸生成己二酸的酶活力的氨基酸突变子，其包括位于野生烯酸还原酶的如
SEQ ID NO.1
所示的氨基酸序列
N
端到
C
端的第
27
位
GLY
突变成
MET、
第
287
位
HIS
突变成
ILE、
第
287
位
HIS
突变成
MET、
第
287
位
HIS
突变成
VAL、
第
371
位
MET
突变成
HIS、
第
371
位
MET
突变成
ASN、
第
371
位
MET
突变成
SER、
第
374
位
ILE
突变成
SER、
第
374
位
ILE
突变成
THR
的突变中的一个或几个
。
[0006]本专利技术第二方面提供了一种催化粘康酸生成己二酸的烯酸还原酶的突变体蛋白，其序列包含位于野生烯酸还原酶的如
SEQ ID NO.1
所示的氨基酸序列从
N
端到
C
端的第
27
位
GLY
突变成
MET、
第
287
位
HIS
突变成
ILE、
第
287
位
HIS
突变成
MET、
第
287
位
HIS
突变成
VAL、
第
371
位
MET
突变成
HIS、
第
371
位
MET
突变成
ASN、
第
371
位
MET
突变成
SER、
第
374
位
ILE
突变成
SER、
第
374
位
ILE
突变成
THR
的突变中的一个或几个
。
[0007]在本专利技术的一些实施例中，所述突变体蛋白为1号烯酸还原酶突变体蛋白，其序列中包含位于野生烯酸还原酶的如
SEQ ID NO.1
所示的氨基酸序列从
N
端到
C
端的第
27
位
GLY
突变成
MET
的突变，本专利技术中简称为蛋白
ERBC
突变体
G27M。
[0008]在本专利技术的一些具体优选的实施例中，所述1号烯酸还原酶突变体蛋白的序列如
SEQ ID NO.2
所示
。
[0009]在本专利技术的一些实施例中，所述突变体蛋白为2号烯酸还原酶突变体蛋白，其序列中包含位于野生烯酸还原酶的如
SEQ ID NO.1
所示的氨基酸序列从
N
端到
C
端的第
287
位
HIS
突变成
ILE
的突变，本专利技术中简称为
ERBC
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种影响烯酸还原酶催化粘康酸生成己二酸的酶活力的氨基酸突变子，其包括位于野生烯酸还原酶的如
SEQ ID NO.1
所示的氨基酸序列
N
端到
C
端的第
27
位
GLY
突变成
MET、
第
287
位
HIS
突变成
ILE、
第
287
位
HIS
突变成
MET、
第
287
位
HIS
突变成
VAL、
第
371
位
MET
突变成
HIS、
第
371
位
MET
突变成
ASN、
第
371
位
MET
突变成
SER、
第
374
位
ILE
突变成
SER、
第
374
位
ILE
突变成
THR
的突变中的一个或几个
。2.
一种催化粘康酸生成己二酸的烯酸还原酶的突变体蛋白，其序列包含位于野生烯酸还原酶的如
SEQ ID NO.1
所示的氨基酸序列从
N
端到
C
端的第
27
位
GLY
突变成
MET、
第
287
位
HIS
突变成
ILE、
第
287
位
HIS
突变成
MET、
第
287
位
HIS
突变成
VAL、
第
371
位
MET
突变成
HIS、
第
371
位
MET
突变成
ASN、
第
371
位
MET
突变成
SER、
第
374
位
ILE
突变成
SER、
第
374
位
ILE
突变成
THR
的突变中的一个或几个
。3.
根据权利要求2所述的烯酸还原酶的突变体蛋白，其特征在于，所述突变体蛋白为1号烯酸还原酶突变体蛋白，其序列中包含位于野生烯酸还原酶的如
SEQ ID NO.1
所示的氨基酸序列从
N
端到
C
端的第
27
位
GLY
突变成
MET
的突变；优选地，所述1号烯酸还原酶突变体蛋白的序列如
SEQ ID NO.2
所示；和
/
或，所述突变体蛋白为2号烯酸还原酶突变体蛋白，其序列中包含位于野生烯酸还原酶的如
SEQ ID NO.1
所示的氨基酸序列从
N
端到
C
端的第
287
位
HIS
突变成
ILE
的突变；优选地，所述2号烯酸还原酶突变体蛋白的序列如
SEQ ID NO.3
所示；和
/
或，所述突变体蛋白为3号烯酸还原酶突变体蛋白，其序列中包含位于野生烯酸还原酶的如
SEQ ID NO.1
所示的氨基酸序列从
N
端到
C
端的第
371
位
MET
突变成
ASN
的突变；优选地，所述3号烯酸还原酶突变体蛋白的序列如
SEQ ID NO.4
所示；和
/
或，所述突变体蛋白为4号烯酸还原酶突变体蛋白，其序列中包含位于野生烯酸还原酶的如
SEQ ID NO.1
所示的氨基酸序列从
N
端到
C
端的第
371
位
MET
突变成
HIS
的突变；优选地，所述4号烯酸还原酶突变体蛋白的序列如
SEQ ID NO.5
所示；和
/
或，所述突变体蛋白为5号烯酸还原酶突变体蛋白，其序列中包含位于野生烯酸还原酶的如
SEQ ID NO.1
所示的氨基酸序列从
N
端到
C
端的第
374
位
ILE
突变成
SER
的突变；优选地，所述5号烯酸还原酶突变体蛋白的序列如
SEQ ID NO.6
所示；和
/
或，所述突变体蛋白为6号烯酸还原酶突变体蛋白，其序列中包含位于野生烯酸还原酶的如
SEQ ID NO.1
所示的氨基酸序列从
N
端到
C
端的第
374
位
ILE
突变成
THR
的突变；优选地，所述6号烯酸还原酶突变体蛋白的序列如
SEQ ID NO.7
所示；和
/
或，所述突变体蛋白为7号烯酸还原酶突变体蛋白，其序列中包含位于野生烯酸还原酶的如
SEQ ID NO.1
所示的氨基酸序列从
N
端到
C
端的第
27
位
GLY
突变成
MET
，第
374
位
ILE
突变成
THR
的突变；优选地，所述7号烯酸还原酶突变体蛋白的序列如
SEQ ID NO.8
所示；和
/
或，所述突变体蛋白为8号烯酸还原酶突变体蛋白，其序列中包含位于野生烯酸还原酶的如
SEQ ID NO.1
所示的氨基酸序列从
N
端到
C
端的第
27
位
GLY
突变成
MET
，第
374
位
ILE
突变成
SER
的突变；优选地，所述8号烯酸还原酶突变体蛋白的序列如
SEQ ID NO.9
所示；和
/
或，所述突变体蛋白为9号烯酸还原酶突变体蛋白，其序列中包含位于野生烯酸还原酶的如
SEQ ID NO.1
所示的氨基酸序列从
N
端到
C
端的第
371
位
MET
突变成
ASN
，第
374
位
ILE
突变成
THR
的突变；优选地，所述9号烯酸还原酶突变体蛋白的序列如
SEQ ID NO.10
所示；和
/
或，所述突变体蛋白为
10
号烯酸还原酶突变体蛋白，其序列中包含位于野生烯酸还
原酶的如
SEQ ID NO.1
所示的氨基酸序列从
N
端到
C
端的第
371
位
MET
突变成
HIS
，第
374
位
ILE
突变成
SER
的突变；优选地，所述
10
号烯酸还原酶突变体蛋白的序列如
SEQ ID NO.11
所示；和
/
或，所述突变体蛋白为
11
号烯酸还原酶突变体蛋白，其序列中包含位于野生烯酸还原酶的如
SEQ ID NO.1
所示的氨基酸序列从
N
端到
C
端的第
287
位
HIS
突变成
ILE
，第
374
位
ILE
突变成
SER
的突变；优选地，所述
11
号烯酸还原酶突变体蛋白的序列如
SEQ ID NO.12
所示；和
/
或，所述突变体蛋白为
12
号烯酸还原酶突变体蛋白，其序列中包含位于野生烯酸还原酶的如
SEQ ID NO.1
所示的氨基酸序列从
N
端到
C
端的第
27
位
GLY
突变成
MET
，第
287
位
HIS
突变成
MET
，第
374
位
ILE
突变成
THR
的突变；优选地，所述
12
号烯酸还原酶突变体蛋白的序列如
SEQ ID NO.13
所示；和
/
或，所述突变体蛋白为
13
号烯酸还原酶突变体蛋白，其序列中包含位于野生烯酸还原酶的如
SEQ ID NO.1
所示的氨基酸序列从
N
端到
C
端的第
27
位
GLY
突变成
MET
，第
371
位
MET
突变成
SER
，第
374
位
ILE
突变成
THR
的突变；优选地，所述
13
号烯酸还原酶突变体蛋白的序列如
SEQ ID NO.14
所示；和
/
或，所述突变体蛋白为
14
号烯酸还原酶突变体蛋白，其序列中包含位于野生烯酸还原酶的如
SEQ ID NO.1
所示的氨基酸序列从
N
端到
C
端的第
27
位
GLY
突变成
MET
，第
287
位
HIS
突变成
ILE
，第
371
位
MET
突变成
SER
的突变；优选地，所述
14
号烯酸还原酶突变体蛋白的序列如
SEQ ID NO.15
所示；和
/
或，所述突变体蛋白为
15
号烯酸还原酶突变体蛋白，其序列中包含位于野生烯酸还原酶的如
SEQ ID NO.1
所示的氨基酸序列从
N
端到
C
端的第
27
位
GLY
突变成
MET
，第
287
位
HIS
突变成
VAL
，第
374
位
ILE
突变成
SER
的突变；优选地，所述
15
号烯酸还原酶突变体蛋白的序列如
SEQ ID NO.16
所示
。4.
根据权利要求2或3所述的烯酸还原酶的突变体蛋白，其特征在于，所述突变体蛋白还包括上述烯酸还原酶突变体蛋白的
N
端或
C
端连接标签得到的融合蛋白；优选地，所述标签包括
His
标签和
/
或
SUMO
标签；进一步优选地，所述突变体蛋白还包括由1号烯酸还原酶突变体蛋白
、2
号烯酸还原酶突变体蛋白
、3
号烯酸还原酶突变体蛋白
、4
号烯酸还原酶突变体蛋白
、5
号烯酸还原酶突变体蛋白
、6
号烯酸还原酶突变体蛋白
、7

【专利技术属性】
技术研发人员：谭天伟，贺科钦，张世鼎，陈必强，崔子恒，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：