一种肠球菌膜囊泡的提取和纯化方法技术

本发明专利技术提供一种肠球菌膜囊泡的提取和纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：肠球菌培养：步骤2：粗提肠球菌膜囊泡：步骤

【技术实现步骤摘要】
一种肠球菌膜囊泡的提取和纯化方法


[0001]本专利技术属于细菌膜囊泡提取
，具体为一种肠球菌膜囊泡的提取和纯化方法
。

技术介绍

[0002]细菌膜囊泡
(bacteria membrane vesicles
，
BMVs)
是一类由细菌分泌的双层膜状球形小体，包裹有蛋白质
、
核酸
、
代谢物等物质，可以促进细菌间及细菌与宿主间的交流，在维持细菌生存
、
引起宿主细胞损伤
、
验证免疫反应等过程中发挥重要作用
。
革兰氏阳性菌细胞壁厚而致密，且缺乏外膜结构，由其产生的
BMVs
仅由细菌细胞质膜包裹，故命名为细胞质膜囊泡
(cytoplasmic membrane vesicles
，
CMVs)。
革兰氏阴性菌细胞壁较薄且含有较多的脂质结构，因此主要有两种产生囊泡的途径：由于肽聚糖生物合成的不平衡或疏水分子插入外膜，引起细菌细胞包膜的紊乱，产生外膜囊泡
(outer membrane vesicles
，
OMVs)
；由噬菌体衍生的细胞內溶素降解肽聚糖细胞壁，引起细胞聚集爆炸，破碎的膜片段向上聚集并组装成外
‑
内膜囊泡
(outer
‑
inner membrane vesicles
，
OIMVs)
和爆炸性外膜囊泡
(explosive outer
‑
membrane vesicles
，
EOMVs)
，这种方式产生的囊泡包含有遗传物质和蛋白质等多种物质
。
[0003]肠球菌是广泛分布于自然环境及人和动物消化道内的一种革兰氏阳性菌
。
肠球菌作为一种重要病原菌，不仅可引起尿路感染
、
皮肤组织感染，还可引起危及生命的腹腔感染
、
败血症
、
心骨膜炎和脑膜炎，由于其存在固有耐药性，致使临床治疗困难，因此由肠球菌引起的严重感染发生率和病死率明显升高
。
因此提取肠球菌分泌的外膜囊泡，有助于鉴定其携带的耐药基因和代谢物，分析研究阻断由囊泡引起的耐药性传播现象；也有助于探究是否可以借用囊泡为载体，治疗肠球菌感染病例，填补肠球菌囊泡提取空白
。
[0004]目前，常用的外泌体提取方法有差速超速离心法
、
超滤法
、
切向流过滤法
、
分子排阻色谱法和集成微流控法等提取方式
。
这些提取技术的缺点比较明显：
1)
差速超速离心法对大样本量的提取耗时比较长，高强度的离心力可能会对囊泡造成机械损伤，容易造成脂蛋白等聚集，严重影响提取纯度；
2)
超滤法提取时垂直的剪切力能够引起膜的堵塞，不适用于大样本量的提取；
3)
切向流过滤法提取技术类似于超滤法，可以有效减少潜在的堵塞，但是纯化不完全，此方法提取的囊泡中杂质较多；
4)
分子排阻色谱法原理是根据分子的尺寸大小进行分离，但是会导致纯化后的外泌体样本被严重稀释，需要额外的外泌体富集方法来浓缩；
5)
集成微流控法只适用于从少量样本中分离外泌体
。
已知的囊泡提取方法缺点明显，不适用于大量样本提取或者提取产物纯度不高，本专利技术结合已知的技术优势，加入实验室长期提取囊泡过程中遇到的问题解决与创新，在大量样本快速提取纯化提取囊泡过程中的效果显著
。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种肠球菌膜囊泡的提取和纯化方法，以期解决
技术介绍

中的问题
。
[0006]本专利技术目的通过以下技术方案来实现：
[0007]一种肠球菌的膜囊泡的提取和纯化方法，包括以下步骤：
[0008]步骤1：肠球菌培养：
[0009]步骤2：粗提肠球菌膜囊泡：
[0010]步骤
2.1
：祛除菌体；
[0011]步骤
2.2
：祛除杂质；
[0012]步骤
2.3
：浓缩粗提；
[0013]步骤3：蔗糖密度梯度离心纯化囊泡；
[0014]步骤
3.1
：超速离心收集囊泡；
[0015]步骤
3.2
：蔗糖密度梯度配置；
[0016]步骤
3.3
：密度梯度离心；
[0017]步骤
3.4
：收集囊泡
。
[0018]所述细菌培养；包括：在
pfizer
肠球菌选择性培养基上划线，放置于
37℃
过夜培养；从过夜培养的复苏培养皿中挑取单菌落重新划线
LB
固体培养基，并放置于
37℃
过夜培养；从活化肠球菌
LB
固体培养基中挑取肠球菌单菌落放入装有
3ml MHB
肉汤培养基的
5ml
无菌离心管中，培养3‑
6h
，然后吸取
200
‑
600
μ
l
加入
3L MHB
培养基中培养至
OD
600
值为
0.8
‑
1.2。
[0019]所述步骤
2.1
：祛除菌体，包括：将培养好的菌液加入
50ml
离心管中，设置
10000rpm
‑
14000rpm
，不高于
16℃
，离心机显示温度低于
20℃
之后再启动离心机，离心
15
‑
30min
，弃沉淀收集上清
。
[0020]所述步骤
2.2
：祛除杂质，包括：将收集到的上清液通过
0.45
μ
m
滤膜过滤，除去上清中离心没有除去的大分子杂质；再使用
0.22
μ
m
滤膜过滤，提纯囊泡
。
[0021]所述步骤
2.3
：浓缩粗提包括：将过滤完成的上清液通过切向流膜包浓缩囊泡，至囊泡浓缩液体积为
180ml
‑
260ml
，浓缩过程始终至于冰上或者维持室温始终不高于
16℃
，如果不能立即进行超速离心操作，应将浓缩液放置于
4℃
冰箱过夜保存，不能放置时间过久
。
[0022]所述步骤
3.1
：超速离心收集囊泡包括：提取的囊泡粗提液使用超高速离心机，设置离心力
100000
‑
140000g...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种肠球菌膜囊泡的提取和纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：肠球菌培养：步骤2：粗提肠球菌膜囊泡：步骤
2.1
：祛除菌体；步骤
2.2
：祛除杂质；步骤
2.3
：浓缩粗提；步骤3：蔗糖密度梯度离心纯化囊泡；步骤
3.1
：超速离心收集囊泡；步骤
3.2
：蔗糖密度梯度配置；步骤
3.3
：密度梯度离心；步骤
3.4
：收集囊泡
。2.
根据权利要求1所述的一种肠球菌膜囊泡的提取和纯化方法，其特征在于，所述细菌培养；包括：在
pfizer
肠球菌选择性培养基上划线，放置于
37℃
过夜培养；从过夜培养的复苏培养皿中挑取单菌落重新划线
LB
固体培养基，并放置于
37℃
过夜培养；从活化肠球菌
LB
固体培养基中挑取肠球菌单菌落放入装有
3ml MHB
肉汤培养基的
5ml
无菌离心管中，培养3‑
6h
，然后吸取
200
‑
600
μ
l
加入
3L MHB
培养基中培养至
OD
600
值为
0.8
‑
1.2。3.
根据权利要求2所述的一种肠球菌膜囊泡的提取和纯化方法，其特征在于，所述步骤
2.1
：祛除菌体，包括：将培养好的菌液加入
50ml
离心管中，设置
10000rpm
‑
14000rpm
，不高于
16℃
，离心机显示温度降至
20℃
以下再启动离心机，离心
15
‑
30min
，弃沉淀收集上清
。4.
根据权利要求3所述的一种肠球菌膜囊泡的提取和纯化方法，其特征在于，所述步骤
2.2
：祛除杂质，包括：将收集到的上清液通过
0.45
μ
m
滤膜过滤，除去上清中离心没有除去的大分子杂质；再使用
0.22
μ
m
滤膜进一步过滤，提纯囊泡
。5.
根据权利要求4所述的一种肠球菌膜囊泡的提取和纯化方法，其特征在于，所述步骤
2.3
：浓缩粗提包括：将过滤完成的上清液通过切向流膜包浓缩囊泡，浓缩过程始终至于冰上或者维持室温始终不高于
16℃
，至囊泡浓缩液体积为
180ml
‑
260ml。6.
根据权利要求5所述的一种肠球菌膜囊泡的提取和纯化方法，其特征在于，所述步骤
3.1
：超速离心收集囊泡包括：提取的囊泡粗提液使用超高速离心机，设置离心力
100000
‑
140000g
，温度0‑
16℃

【专利技术属性】
技术研发人员：唐艺芝，赵蒙宇，王红宁，雷昌伟，张安云，杨鑫，陈兴贵，林小龙，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：