鸡新城疫和禽流感制造技术

本发明专利技术涉及一种用于预防鸡新城疫和禽流感

【技术实现步骤摘要】
鸡新城疫和禽流感H9亚型二联灭活口服免疫原组合物及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及兽药领域，具体涉及一种用于鸡新城疫和禽流感
H9
亚型二联灭活口服免疫原组合物及其制备方法和应用
、
及包括其口服免疫原组合物及其制备方法和应用
。

技术介绍

[0002]新城疫病毒
(Newcastledisease virus
，
NDV)
又称亚洲鸡瘟病毒
、
伪鸡瘟病毒或禽肺脑炎病毒
。
新城疫病毒是
ssRNA
病毒，有包膜
。
病毒颗粒具多形性，有圆形
、
椭圆形和长杆状等
。
成熟的病毒粒子直径
100
～
400nm。
该病毒主要危害鸡
、
珠鸡和火鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，强毒株可使鸡群全群毁灭
。
弱毒株仅引起鸡群呼吸道感染和产蛋量下降，但可迅速康复
。
对新城疫病的免疫防治，应以预防接种为主要措施
。
[0003]禽流感
(Avian Influenza
，简称
AI)
是由正黏病毒科流感病毒属
A
型流感病毒引起的一种禽类或者动物的感染或疾病综合征
。
按病原体的致病性，禽流感可分为高致病性禽流感
(Highly pathogenic avian influenza<br/>，
HPAI)
和低致病性禽流感
(Lowly pathogenic avian influenza
，
LPAI)。
[0004]H9N2
亚型禽流感病毒属于低致病性禽流感病毒，可造成产蛋鸡发生呼吸道症状
、
产蛋率下降，肉鸡引发呼吸道症状，造成感染鸡体质下降，继发细菌性疾病，从而造成死亡率升高
。1966
年研究人员首次从火鸡体内分离到
H9N2
亚型禽流感病毒后，相继从鸡
、
野鸡
、
鸭和鹌鹑等多种动物体内分离到
。
国内郭元吉等于
1980
年从鸭的饮用水中首次分离到，
1994
年后，从鸡群中大量分离出病毒，该病毒逐渐成为威胁我国养禽业健康发展的重要疫病之一
。
[0005]白喉毒素
(diphtheria toxin
，
DT)
是由感染
β
噬菌体基因组的白喉棒状杆菌所产生的外毒素，具有强的细胞毒性
。
交叉反应物质
197(ccross
‑
reacting material 197
，
CRM197)
是
DT
无毒突变体
。
常作为安全有效的人类免疫蛋白载体广泛用于生物医药领域
。CRM197
作为可以显著提高目标病毒蛋白的免疫原性，并且提高实验动物高滴度的中和抗体，在戊型肝炎
、
寨卡病毒型疫苗，禽流感融合表达疫苗的开发领域得到广泛应用
。CRM197
通过抑制表皮细胞因子的生长，使其生长受阻，从而达到治疗肿瘤的目的
。CRM197
作为一种广泛应用的蛋白分子，不仅能够在病毒蛋白疫苗，细菌多糖结合疫苗等领域的提高目的蛋白的免疫原性，而且能够作为免疫佐剂的分子蛋白，提高机体的细胞免疫和体液免疫水平，并且用于肿瘤的治疗有明显的效果
。
[0006]现在市场上用于预防鸡新城疫和禽流感的疫苗分为活疫苗和灭活疫苗两个大的类别，例如：
[0007]1)
活疫苗，通常为弱毒活病毒，进行滴鼻和饮水免疫，但是缺乏灭活疫苗的高血清抗体，免疫后鸡群仅获得部分保护率，会加重鸡群的呼吸道反应
。
主要原因在于，过分减毒会使效力不足；减毒不够又有致病可能
。
[0008]2)
灭活疫苗，一般利用油佐剂制备，采用颈部皮下或胸部肌肉注射途径接种鸡群
。
为了减少注射应激和注射成本，尽量采用小日龄
(1
～7日龄
)
注射或者成鸡
(60
～
110
日龄
)
的胸部肌肉注射，其他日龄进行疫苗接种的较少，这样加大了免疫空白期
。
[0009]另外，虽然灭活疫苗更加安全，但灭活疫苗因为是灭活病毒，免疫期短，需要多次注射，大大增加了养殖场主的工作量
。
[0010]从理论上，要想获得最佳的保护效果，就要求疫苗株的抗原性和流行的病原是相互匹配的
。
现在亟待需求开发适合动物多种途径接种免疫的疫苗，减少应激，增加使用的日龄阶段，也是今后增加群体保护率的方向
。
[0011]因此，尝试制备新城疫和禽流感
H9
型的灭活口服疫苗，具有重大的实际意义和广阔的市场开发场景，但存在的困难有：
1)
灭活病毒采用的佐剂通常为油佐剂，与水相的机体内环境不能互溶，并且油佐剂粘度高，一般在
80
～
100cp
，没有流动效应，很难用于口服，因此需要研发一种新的佐剂；
2)
由于灭活病毒并不能继续繁殖，如何使灭活病毒在口服后能够维持高水平的血清抗体，也是研究难点
。

技术实现思路

[0012]专利技术目的
[0013]本专利技术的目的在于提供一种用于预防鸡新城疫和禽流感
H9
亚型的二联灭活口服免疫原组合物及其制备方法和应用
。
[0014]本专利技术采用的佐剂复合物是以高分子
F127、
壳聚糖
、
黄芪多糖
、CRM197
蛋白分子为主要成分，主要功能是通过高分子
F127、
壳聚糖的交联作用，在植物提取物黄芪多糖的作用下提高机体的细胞免疫和体液免疫能力
。CRM197
蛋白分子充分激活肠上皮细胞的吞噬功能，激活体液免疫反应，从而协同抗原分子发挥免疫效力
。
水佐剂能够满足口服的应用需求，同时口服免疫主要是利用机体的肠粘膜免疫系统的免疫反应
。
因此，本专利技术的用于预防鸡新城疫和禽流感
(H9
亚型
)
的二联口服免疫原组合物可以免疫鸡维持高水平的血清抗体
(
能与注射疫苗相当
)
，在任何日龄均可进行免疫，免疫鸡群无接种应激，解决了灭活疫苗难以通过口服获得高水平血清抗体的问题
。
鸡新城疫和禽流感二联灭活口服免疫原组合物的应用具有重大的实际意义和广阔的市场开发前景
。
[0015]解决方案
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种用于预防鸡新城疫和禽流感
H9
亚型的二联灭活口服免疫原组合物，其特征在于，包括体积比为
(2
～
4)
：1的灭活抗原和水佐剂复合物；所述灭活抗原包括至少一种灭活的鸡新城疫全病毒抗原和至少一种灭活的禽流感
H9
亚型全病毒抗原；所述水佐剂复合物为水溶性佐剂，其包括水溶性助剂和白喉毒素突变体
CRM197
蛋白；其中，水溶性助剂包括如下重量份数的原料：泊洛沙姆聚醚4～8重量份，葡聚糖1～2重量份，黄芪多糖
0.2
～
0.5
重量份；白喉毒素突变体
CRM197
蛋白在佐剂复合物中的浓度为
100
～
400mg/L。2.
根据权利要求1所述的二联灭活口服免疫原组合物，其特征在于，水溶性助剂包括如下重量份数的原料：泊洛沙姆聚醚8重量份，葡聚糖2重量份，黄芪多糖
0.5
重量份；可选地，水溶性助剂中还包括生理盐水，可选地，生理盐水补足至
100
重量份；可选地，所述泊洛沙姆聚醚为
F127
；可选地，所述黄芪多糖中，每
1g
黄芪多糖以葡萄糖计，不少于
150mg。3.
根据权利要求1或2所述的二联灭活口服免疫原组合物，其特征在于，所述灭活抗原和水佐剂复合物的体积比为
(2
～
4)
：1，可选地为2：1或4：1；和
/
或，所述灭活抗原中，鸡新城疫全病毒抗原和禽流感
H9
亚型全病毒抗原的病毒体积含量比为
(0.5
～
2)
：1，可选地为1：1，和
/
或，所述灭活抗原中病毒含量均不低于
10
9.0
EID
50
/0.1ml
，可选地病毒含量均为
10
9.3
～
10
9.5
EID
50
/0.1ml。4.
根据权利要求1至3任一所述的二联灭活口服免疫原组合物，其特征在于，其为液体水剂形式
。5.
一种权利要求1至4任一所述的二联灭活口服免疫原组合物的制备方法，其特征在于，将灭活抗原与所述水佐剂复合物混合，在
20
～
25℃
，
100
～
200r/min
的搅拌罐中混合，搅拌4～6小时，调整
pH
为
6.5
～
7.5
，获得二联灭活口服免疫原组合物
。6.
根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述灭活抗原的制备方法包括：
A)
将鸡新城疫
La Sota
株病毒接种小日龄
SPF
鸡，接种后6日，取脏器组织研磨后获得组织病毒液，按照
100
～
1000
倍稀释后接种小日龄非免疫鸡胚，孵育
72
～
96
小时后收获，病毒含量
10
9.3
～
10
9.5
EID
50
/0.1ml
；
B)
将禽流感
H9
亚型
WD
株病毒接种小日龄
SPF
鸡，接种后6日，取脏器组织研磨后获得组织病毒液，按照
100
～
1000
倍稀释后接种小日龄非免疫鸡胚，孵育
72
～
96
小时后收获，病毒含量
10
9.3
～
10
9.5
EID
50
/0.1ml。7.
一种权利要求1至4任一所述的鸡新城疫和禽流感
H9
亚型二联灭活口服免疫原组合物或权利要求5至6任...

【专利技术属性】
技术研发人员：尚川川，郭智伟，张贵新，徐志新，郭小燕，张爽，赵卓，赵志超，江厚生，
申请(专利权)人：北京华夏兴洋生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：