本发明专利技术提供了一种鸡新城疫、禽流感和禽腺病毒三联灭活疫苗及其制备方法，属于禽类疫苗领域。本发明专利技术的制备方法包括：以灭活后的鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、Fiber-2蛋白为活性成分，加上药学上可接受的免疫佐剂及其它辅助性成分，即得；所述鸡新城疫病毒是通过鸭胚视网膜全悬浮细胞培养得到的；所述H9亚型禽流感病毒是通过MDCK细胞培养得到的。本发明专利技术的疫苗具有良好的安全性，以及优于传统鸡胚疫苗的保护率，在疫苗产业中具有良好应用前景。在疫苗产业中具有良好应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种鸡新城疫、H9亚型禽流感和禽腺病毒三联灭活疫苗
[0001]本专利技术属于禽类疫苗领域。
技术介绍
[0002]鸡新城疫(Newcastle disease，ND)是对养禽业危害最大的病毒性传染病之一，该病被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病，给世界各国的养禽业造成了巨大损失。系统的分子流行病学调查结果显示，近年来我国ND流行毒株以基因VII型为主，与我国目前广泛使用的疫苗株La Sota和Clone 30等存在明显差异，虽然鸡群在整个饲养期内进行过多次常规疫苗免疫，但仍有感染强毒株引起流行的可能性，临床上主要表现为非典型性ND的发生，证实目前所使用疫苗的免疫保护力不足，因此开发免疫原性更好、与目前流行株更匹配的疫苗已经成为ND疫苗研发的趋势和当务之急。
[0003]我国自1994年报道鸡群中发生H9亚型禽流感以来，该病在我国大多数省份流行，尽管各级农业部门和养禽企业采取了多种防治措施，但该病对养禽业仍造成了巨大的损失。
[0004]禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)属于禽腺病毒科禽腺病毒属，能够引起鸡心包积液-包涵体肝炎综合征的主要是I群4型禽腺病毒(FAdV-4)，2015年，我国安徽、河南和山东等省份鸡群中相继爆发了以心包积液、肝脏肿大出血等特征病变的疾病，经鉴定为FAdV-4引起，其致死率甚至可达80％，给养殖业造成巨大的经济损失。目前，国内尚无商品化的疫苗用来防控此疾病。Fiber-2蛋白作为FAdV-4的主要保护性抗原，是研究FAdV-4亚单位疫苗最佳选择。r/>[0005]目前鸡新城疫、H9亚型禽流感和禽腺病毒三联灭活疫苗的生产依赖鸡胚培养新城疫、H9亚型禽流感病毒。鸡胚生产鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒需要大量的易感鸡胚，成本较高，病毒产量易受鸡胚的来源、品质等因素影响，疫苗纯度差，生产周期长，工作繁重，导致能源的极大消耗，收获病毒后，产生大量带毒废胚体，造成大量废弃物，且如果处理不彻底，存在散毒风险。
技术实现思路
[0006]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种新的鸡新城疫、禽流感和禽腺病毒三联灭活疫苗及其制备方法。
[0007]本专利技术的技术方案包括：
[0008]一种鸡新城疫、禽流感和禽腺病毒三联灭活疫苗制备方法，其特征在于，它是以灭活后的鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、Fiber-2蛋白为活性成分，加上药学上可接受的免疫佐剂及其它辅助性成分，即得；
[0009]所述鸡新城疫病毒是通过鸭胚视网膜全悬浮细胞培养得到的；
[0010]所述H9亚型禽流感病毒是通过MDCK细胞培养得到的。
[0011]前述的三联灭活疫苗制备方法，包括如下步骤：
[0012]1)病毒培养：使用鸭胚视网膜全悬浮细胞培养鸡新城疫病毒，使用MDCK细胞培养H9亚型禽流感病毒；
[0013]2)病毒灭活；
[0014]3)油相制备：注射用白油94～98体积份，加入司本-802～6体积份，灭菌；
[0015]4)水相制备：将灭活病毒与Fiber-2蛋白分别溶于水，配成蛋白含量为300-420μg/ml，按(1-2)∶(1-2)∶(1-2)的体积比混合，取混合后得抗原液，94～99体积份抗原液与1～6体积份吐温-80混合；
[0016]5)乳化：水相和油相按1∶(1.5～3)的体积比混合乳化。
[0017]前述的三联灭活疫苗制备方法，步骤1)培养至HA效价不低于8log2时，收获病毒液。
[0018]前述的三联灭活疫苗制备方法，步骤2)的灭活方式为甲醛灭活。
[0019]前述的三联灭活疫苗制备方法，步骤2)还包括对病毒进行超滤浓缩。
[0020]前述的三联灭活疫苗制备方法，步骤3)的白油为94体积份；
[0021]和/或，步骤3)中司本-80位6体积份；
[0022]和/或，步骤4)中蛋白含量为360μg/ml；
[0023]和/或，步骤4)中的体积比为1∶1∶1；
[0024]和/或，步骤4)中96体积份的抗原液与4体积份的吐温-80混合；
[0025]和/或，步骤5)中的水相和油相的体积比是1∶2。
[0026]前述的三联灭活疫苗制备方法，步骤1)中新城疫病毒为aSG10株；和/或，H9禽流感病毒为G株。
[0027]前述的三联灭活疫苗制备方法，步骤1)中新城疫病毒的制备方法为：
[0028]将鸭胚视网膜全悬浮细胞在逐级放大传代培养；当细胞密度为8.0
×
106/ml以上时，新城疫病毒，同时添加DMEM培养基，使DMEM培养基浓度被稀释至原浓度的10％～20％；每日添加终浓度为3-7μg/ml的胰酶，在温度为33～37℃条件下培养，收毒即可；
[0029]优选地，所述DMEM培养基浓度被稀释至原浓度的15％；
[0030]优选地，所述胰酶终浓度为5μg/ml；
[0031]优选地，温度为35℃。
[0032]如前述的三联灭活疫苗制备方法，步骤1)中禽流感病毒的制备方法如下：
[0033]将MDCK细胞逐级放大培养；当细胞密度为(5-7)
×
106/ml时，接种H9亚型禽流感病毒，同时添加终浓度为4-8μg/ml的胰酶溶液，每日添加一次相同剂量的胰酶溶液，培养48h，取样检测HA效检，当HA效价不低于8log2时，收获病毒液；冻融3次，备用；
[0034]优选地，所述胰酶的添加终浓度为6μg/ml。
[0035]前述任一方法制备得到的三联疫苗。
[0036]本专利技术具有如下有益效果：
[0037]1)本专利技术的安全性和传统的鸡胚疫苗一致，不会引起鸡的不良反应。
[0038]2)本专利技术相比传统鸡胚苗具有更高的保护率。
[0039]显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0040]以下通过具体实施方式对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此
理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。
具体实施方式
[0041]实施例1本专利技术的三联疫苗制备
[0042]1 NDV细胞毒制备
[0043]将AGE1细胞(鸭胚视网膜全悬浮细胞)逐级放大传代至7L的生物反应器中，培养液体积为4～5L，pH值设置为7.15，溶氧值设置为60％，转速设置为150r/min，37℃培养。当细胞密度为8.0
×
106/ml以上时，以0.0001MOI接种NDV aSG10株病毒，同时添加DMEM培养基，使DMEM培养基浓度被稀释至原浓度的15％；以及添加终浓度为5μg/ml的胰酶溶液，每日添加一次相同剂量的胰酶溶液，将培养温度调至35℃，培养72h，取样检测HA效检，当HA效价不低于8log2时，收获病毒液。冻融本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种鸡新城疫、禽流感和禽腺病毒三联灭活疫苗制备方法，其特征在于，它是以灭活后的鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、Fiber-2蛋白为活性成分，加上药学上可接受的免疫佐剂及其它辅助性成分，即得；所述鸡新城疫病毒是通过鸭胚视网膜全悬浮细胞培养得到的；所述H9亚型禽流感病毒是通过MDCK细胞培养得到的。2.如权利要求1所述的三联灭活疫苗制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)病毒培养：使用鸭胚视网膜全悬浮细胞培养鸡新城疫病毒，使用MDCK细胞培养H9亚型禽流感病毒；2)病毒灭活；3)油相制备：注射用白油94～98体积份，加入司本-80 2～6体积份，灭菌；4)水相制备：将灭活病毒与Fiber-2蛋白分别溶于水，配成蛋白含量为300-420μg/ml，按(1-2)∶(1-2)∶(1-2)的体积比混合，取混合后得抗原液，94～99体积份抗原液与1～6体积份吐温-80混合；5)乳化∶水相和油相按1∶(1.5～3)的体积比混合乳化。3.如权利要求2所述的三联灭活疫苗制备方法，其特征在于，步骤1)培养至HA效价不低于8log2时，收获病毒液。4.如权利要求2所述的三联灭活疫苗制备方法，其特征在于，步骤2)的灭活方式为甲醛灭活。5.如权利要求2所述的三联灭活疫苗制备方法，其特征在于，步骤2)还包括对病毒进行超滤浓缩。6.如权利要求2所述的三联灭活疫苗制备方法，其特征在于，步骤3)的白油为94重量份；和/或，步骤3)中司本-80位6重量份；和/或，步骤4)中蛋白含量为3...
【专利技术属性】
技术研发人员：邢刚，李成山，丁莉，岳丰雄，左榕琳，黄杰，丁光星，何洪奎，王立斌，王洁清，廖鏖，
申请(专利权)人：马鞍山史记动物健康管理有限公司，
类型：发明
国别省市：
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