犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体、犬冠状病毒三联灭活疫苗制造技术

本发明专利技术公开了一种犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体、犬冠状病毒三联灭活疫苗。本发明专利技术采用我国分离的犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体和犬冠状病毒流行株经灭活后加入佐剂研制而成。本发明专利技术涉及病原体的分离培养、鉴定、灭活方法、生产工艺、疫苗保存和免疫方法。犬三联灭活疫苗用于预防犬型钩端螺旋体病、黄疸出血型钩端螺旋体病和犬冠状病毒病，免疫犬后可产生较高的抗体，对强毒攻击具有很好的保护作用。钩端螺旋体为人畜共患传染病，犬为人类的伴侣动物，宠物犬与人类密切接触，因此，该三联灭活疫苗具有较好的社会效益和重要的公共卫生意义。

Canine Leptospira, icterus haemorrhagic leptospira and canine coronavirus triple inactivated vaccine

【技术实现步骤摘要】
犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体、犬冠状病毒三联灭活疫苗
本专利技术属于生物制品领域。本专利技术涉及犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体、犬冠状病毒病三联灭活疫苗的研制和应用。
技术介绍
犬钩端螺旋体病是由致病性的钩端螺旋体(Leptospira)引起的一种人畜共患传染病。导致犬发生本病的主要血清型为犬型钩端螺旋体(L.canicola)和黄疸出血型钩端螺旋体(L.icterohemorrhagia)。犬感染后主要表现为高热、黄疸、出血性素质、流产等症状。该病多发生于热带及亚热带地区。钩端螺旋体对各种年龄的犬均可感染，潜伏期4～14天。急性病例可突然发生，不食、呕吐、体温升高、精神沉郁、呼吸困难、粘膜黄疸、出血，一般发病3天内因机体衰竭死亡。亚急性症状以发热、呕吐、厌食、脱水、黄疸为特征，病犬粘膜可见有不规则的出血斑和黄疸。慢性症状多以急性或亚急性症归转而来，常以肝、肾及胃肠道症状为主。钩端螺旋体病为世界流行最广泛的人兽共患传染病之一，犬属动物是钩端螺旋体的易感动物，家犬与人、畜相处密切，对诊断和防止人、畜钩端螺旋体病感染和传播，具有重要的公共卫生意义。犬冠状病毒病是由犬冠状病毒(Caninecoronavirus，CCV)引起的犬病毒性传染病。犬冠状病毒呈圆形或椭圆形，直径为80～100nm，表面具有长约20nm的纤突为特征。犬冠状病毒基因组为单股RNA病毒，RNA在复制时采用独特的套式转录，因基因组的错配率和重组率都很高,从而导致冠状病毒的变异株多。犬冠状病毒可感染所有品种和各种年龄的犬(以幼犬受害严重)，是犬的一种多发性、急性胃肠道传染病，传染源主是病犬，传播途径主要是通过污染的饲料、饮水，经消化道感染。该病发病急、传染快、病程短、死亡率高，常与犬细小病毒或轮状病毒混合感染，使病情加剧，因急性腹泻和呕吐而脱水迅速死亡。临床上主要表现为频繁地呕吐、腹泻、沉郁、厌食，是危害养狗业的重要病毒性传染病。犬冠状病毒病呈世界性分布和流行，冠状病毒也是犬传染性呼吸道综合症(CIRD)的重要病原。因此，对犬冠状病毒病的预防具有重要意义。犬三联灭活苗采用在我国自行分离的犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋和犬冠状病毒流行毒株，经过对毒株培养、灭活方法、生产工艺研究，研制犬三联灭活苗，免疫犬后可完全保护强毒攻击。目前国内外有关于犬钩端螺旋体疫苗研究和产品，但目前无犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体、犬冠状病毒三联灭活疫苗。为了达到注射一次同时预防和控制钩端螺旋体病和犬冠状病毒病的目的，研制该犬三联灭活疫苗具有良好的市场前景和推广应用价值。
技术实现思路
随着人们生活水平的不断提高，养犬不断扩大，宠物犬进入千家万户，犬作为人类的伴侣动物，宠物犬与人类密切接触。犬是钩端螺旋体易感动物，容易携带和传播钩端螺旋体病原，同时可以传播给所接触的易感人群，因此对犬进行钩端螺旋体的预防具有重要的公共卫生意义。犬冠状病毒分布广，并对所有品种和各种年龄的犬均易感，发病率高。本专利技术研制的犬三联灭活疫苗，可有效的预防和控制犬型钩端螺旋体病、黄疸出血型钩端螺旋体病和犬冠状病毒病的发生和流行。为达到上述目的，本专利技术采用下述技术方案：本专利技术提供一种犬三联灭活疫苗，其包含灭活的犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体和犬冠状病毒，以及药学上可接受的佐剂。所述犬型钩端螺旋体：黄疸出血型钩端螺旋体：犬冠状病毒：佐剂的比例为3:3:3:1。优选的，所述佐剂为605佐剂。所述犬型钩端螺旋体的保藏编号为CGMCCNO:18505，所述黄疸出血型钩端螺旋体的保藏编号为CGMCCNO:18506，和/或所述犬冠状病毒的保藏编号为CGMCCNO:18507。本专利技术提供一种所述的犬三联灭活疫苗的生产方法，其生产工艺流程包括：菌毒种分离鉴定、培养→测定毒价→收毒→灭活→安全、效力检验→按比例配苗→加佐剂→分装→成品检验→贴签包装。建立了犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体培养方法。用改良Korthof培养基进行传代培养，培养温度28～30℃，培养7～14d，在暗视野显微镜检查400倍观察计数，每毫升的活菌数可达109/mL。犬冠状病毒采用MDCK细胞进行培养传代，单层细胞接种，病毒毒价每毫升可达106.8TCID50。分离株犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体生物学和分子生物学鉴定。分离株犬冠状病毒生物学和分子生物学鉴定。钩端螺旋体菌的灭活，采用100:2.5(V/V)的比例加入0.1MBEI，在室温(25℃左右)下灭活30h。犬冠状病毒的灭活，采用100:2.0(V/V)的比例加入0.1MBEI，在室温(25℃左右)下灭活30h。三联灭活苗各组份的配比，黄疸出血型钩端螺旋体：犬型钩端螺旋体：犬病毒：605佐剂为3：3：3：1。三联灭活苗分装，无菌分装，每瓶2.0mL。三联灭活苗保存2～8℃避光保存，保存期24个月。本专利技术提供所述的犬三联灭活疫苗或所述的犬三联灭活疫苗的生产方法得到的犬三联灭活疫苗在制备用于预防和/或治疗犬型钩端螺旋体病、黄疸出血型钩端螺旋体病和/或犬冠状病毒病的药物中的用途，所述疫苗可用于各种类型的犬，包括怀孕犬。三联灭活苗免疫犬后攻毒保护，免疫犬后用同种强毒攻，可使免疫犬5/5保护。三联灭活苗的免疫程序和免疫剂量为6～8周龄犬首次免疫，每次颈部皮下注射2.0mL，免疫两次，间隔2～3周。免疫期为一年，以后每年免疫一次。本专利技术提供一种分离的核酸，其核苷酸序列如SEQIDNO:1、2或3所示。本专利技术涉及的生物材料资源信息。本发制苗所用的犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体、犬冠状病毒菌毒株为本公司自主分离鉴定和保存，并于2019年9月18日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号分别为CGMCCNO:18505，CGMCCNO:18506，CGMCCNO:18507。本专利技术的优点：1、针对性强：所述犬三联灭活疫苗可同时预防犬型钩端螺旋体病、黄疸出血型钩端螺旋体病和犬冠状病毒病。2、生产工艺简单：所述犬三联灭活疫苗各成分可单独生产，对设备要求不高，适合于工业化大规模生产。3、所述犬三联灭活疫苗的生产成本低，有利于我国普遍推广应用。附图说明图1：钩端螺旋体OmpLl基因扩增电泳图谱。图2：犬冠状病毒RNA凝胶电泳图谱。具体实施方式1、犬型钩端螺旋体和黄疸出血型钩端螺旋体的分离与鉴定(1)采集、培养与形态学鉴定：分别在河北和北京地区养犬场用灭菌容器采集凝似病犬新鲜犬尿液,经0.45μm的微孔滤膜过滤除菌后，无菌操作加于改良Korthof培养基，置28～30℃培养箱中培养，分别于5、7、10、14天取培养液暗视野显微镜检查，可见钩端旋体生长后并转接至新鲜改良Korthof培养基内继续培养，待生长良好作进行一步鉴定。经过分离菌株的培养特性、形态本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种犬三联灭活疫苗，其包含灭活的犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体和犬冠状病毒，以及药学上可接受的佐剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种犬三联灭活疫苗，其包含灭活的犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体和犬冠状病毒，以及药学上可接受的佐剂。


2.根据权利要求1所述的犬三联灭活疫苗，其中犬型钩端螺旋体：黄疸出血型钩端螺旋体：犬冠状病毒：佐剂的比例为3:3:3:1；优选的，所述佐剂为605佐剂。


3.根据权利要求1或2所述的犬三联灭活疫苗，其中所述犬型钩端螺旋体的保藏编号为CGMCCNO:18505，所述黄疸出血型钩端螺旋体的保藏编号为CGMCCNO:18506，和/或所述犬冠状病毒的保藏编号为CGMCCNO:18507。


4.一种根据权利要求1-3任一项所述的犬三联灭活疫苗的生产方法，其生产工艺流程包括：菌毒种分离鉴定、培养→测定毒价→收毒→灭活→安全、效力检验→按比例配苗→加佐剂→分装→成品检验→贴签包装。


5.根据权利要求4所述的生产方法，所述犬型钩端螺旋体和黄疸出血型钩端螺旋体的培养工艺包括：用改良Korthof培养基进行传代培养，培养温度28～30℃，培养7～14d，在暗视野显微镜检查400倍观察计数，使上述两种钩端螺旋体菌生长达109/mL。

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【专利技术属性】
技术研发人员：金扩世，贺亚奇，张良婷，李登亮，胡义彬，李晓亮，李三鹏，尚川川，商云鹏，赵卓，王力，江厚生，
申请(专利权)人：北京华夏兴洋生物科技有限公司，北京生泰尔科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11