一种柱状黄杆菌转基因工程口服疫苗、使用方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种柱状黄杆菌转基因工程口服疫苗，制备步骤如下：⑴分析柱状黄杆菌的保护性抗原基因lip的成熟肽段序列；⑵穿梭质粒的构建；⑶重组菌株的筛选；⑷重组菌株的培养；⑸制备成口服疫苗。本发明专利技术疫苗是一种口服疫苗，通过口服免疫的方式接种，比注射免疫和浸泡免疫疫苗使用方便，更节省劳动力，并具有不受鱼体大小限制的优点。

A recombinant oral vaccine of Flavobacterium columniformis, its usage and Application

【技术实现步骤摘要】
一种柱状黄杆菌转基因工程口服疫苗、使用方法和应用
本专利技术属于分子生物学和水产
，涉及水产动物免疫学，尤其是一种柱状黄杆菌转基因工程口服疫苗、使用方法和应用。
技术介绍
柱状黄杆菌是一种世界范围的水生动物致病菌，为革兰氏阴性杆菌。其宿主范围极为广泛，可感染包括鲤科、鲈科、鲶科、鲑科、太阳科、鲻科等多个科的鱼类，几乎所有的淡水鱼都对其敏感。在我国，柱状黄杆菌主要危害草鱼、鳜鱼、斑点叉尾鮰、泥鳅、金鱼等鱼类，其引起的柱形病为淡水鱼类发病率最高的细菌性疾病，给我国水产养殖业造成了严重的危害。目前，主要通过使用抗生素和消毒剂等化学药物对柱形病进行防治，进行有一定的效果，但随着抗生素的长期使用和乱用所引发的问题已逐渐引进人们的重视。在挪威、美国、日本等水产发达国家，化学药物在水产养殖业中已逐渐被限用或禁用，开发新的防治方法迫在眉睫。其它防治途径相比，利用疫苗进行免疫防治的方法具有针对性强、效果显著、无毒无害、抗病周期长等不可替代的优势，符合高效、绿色、环保理念而日益受到人们的重视。关于柱状黄杆菌疫苗的研究，现有技术目前主要有三方面本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种柱状黄杆菌转基因工程口服疫苗，其特征在于：制备步骤如下：/n⑴分析柱状黄杆菌的保护性抗原基因lip的成熟肽段序列，按照枯草芽孢杆菌的密码子偏好性人工合成lip基因成熟肽段序列，在序列两端分别加入Pst I和SphI酶切位点，并通过在N端加入2个碱基确保序列不移码，在C段去掉了终止密码子TAA，合成后的lip基因序列为SEQ NO.1，共计760bp；/n⑵将步骤⑴中人工合成后的lip基因序列用Pst I和SphI限制性内切酶双酶切后，与用相同限制性内切酶双酶切的载体pBE2R进行连接，构建穿梭质粒pBE2R-lip；/n⑶将步骤⑵中构建的穿梭质粒pBE2R-lip转入枯草芽孢杆菌WB

【技术特征摘要】
1.一种柱状黄杆菌转基因工程口服疫苗，其特征在于：制备步骤如下：
⑴分析柱状黄杆菌的保护性抗原基因lip的成熟肽段序列，按照枯草芽孢杆菌的密码子偏好性人工合成lip基因成熟肽段序列，在序列两端分别加入PstI和SphI酶切位点，并通过在N端加入2个碱基确保序列不移码，在C段去掉了终止密码子TAA，合成后的lip基因序列为SEQNO.1，共计760bp；
⑵将步骤⑴中人工合成后的lip基因序列用PstI和SphI限制性内切酶双酶切后，与用相同限制性内切酶双酶切的载体pBE2R进行连接，构建穿梭质粒pBE2R-lip；
⑶将步骤⑵中构建的穿梭质粒pBE2R-lip转入枯草芽孢杆菌WB800菌株，筛选得到WB800(pBE2R-lip)菌株；
⑷将步骤⑶中筛选得到的WB800(pBE2R-lip)菌株按体积以1:100的接种量接种于含50μg/mL卡纳霉素的LB培养基中，37℃、200rpm/min培养48h后，离心收集细菌；
⑸将步骤⑷中收集到的细菌以3.0×108CFU/饲料的浓度均匀喷洒至饲料中，阴干，制备成口服疫苗，即得柱状黄杆菌转基因工程口服疫苗。


2.根据权利要求1所述的柱状黄杆菌转基因工程口服疫苗，其特征在于：具体制备步骤如下：
⑴从Genbank下载柱状黄杆菌lip基因序列，利用在线软件对其信号肽进行分析，获得lip基因的成熟肽段序列；根据枯草芽孢杆菌密码子的偏好性进行柱状黄杆菌lip基因成熟肽段的合成，在两端分别加入PstI和SphI酶切位点，并通过在前端加入2个碱基确保序列不移码，去掉了终止密码子TAA，合成后序列如SEQNO.1所示，共计760bp；
⑵将人工合成的lip基因片段进行双酶切
每20μL的酶切体系如下：



酶切三个小时后，65℃变性10min，电泳切胶回收；
⑶将双酶切后的表达片段和用同样的内切酶同步酶切的pBE2R载体连接，每10μL的连接体系如下：



16℃连接过夜；
⑷连接产物转化TOP10感受态细胞，PCR筛选重组克...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗璋，张振国，郝爽，白晓慧，冯守明，
申请(专利权)人：天津市水产研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12