一种问号钩端螺旋体MAP疫苗的制备方法技术

本发明专利技术公开了通过构建问号钩端螺旋体LipL21、LipL32、groEL和loa22蛋白的优势T‑和B‑细胞T‑B联合多价抗原表位融合基因及其原核表达系统，表达由抗原表位组成的多抗原肽（multiple antigenic peptide，MAP）与高分子核心载体人工交联制备MAP疫苗。本发明专利技术制备的MAP疫苗免疫效果好、成本较低，能有效诱导细胞免疫，减少了疫苗毒副作用，提高了安全性，增强了免疫针对性。

Preparation of a map vaccine of Leptospira interrogans

The invention discloses a map vaccine prepared by constructing the dominant T \u2011 and B \u2011 cell T \u2011 B fusion gene of Leptospira interrogans lipl21, LipL32, GroEL and loa22 proteins and its prokaryotic expression system, expressing the multiple antigenic peptide (map) composed of antigen epitopes and artificially crosslinking the polymer core carrier. The map vaccine prepared by the invention has good immune effect and low cost, can effectively induce cell immunity, reduces vaccine toxic and side effects, improves safety and enhances immune pertinence.

【技术实现步骤摘要】
一种问号钩端螺旋体MAP疫苗的制备方法
本专利技术属于细胞免疫
，具体涉及一种问号钩端螺旋体MAP疫苗的制备方法。
技术介绍
致病性钩端螺旋体（以下简称钩体）感染可引起的钩体病是全球流行的重要自然疫源性人兽共患传染病[2]。钩体病不仅是纳入国家级监控及计划免疫项目的13种传染病之一，也是自然灾害时我国重点监控和防疫的4种传染病之一。接种疫苗是预防和控制传染病最为有效和经济的手段。然而钩体具有血清群、型众多的特点，而且不同地区优势流行血清群有明显差异，不同血清群间交叉保护作用较弱的特点。因此目前使用当地流行的3-7个优势血清群（型）制备的多价全菌死疫苗不仅副作用大，而且对疫苗中未包含的其他致病性钩体感染无明显的保护作用。近年已发现钩体含有一些属特异性蛋白抗原LipL32、OmpLl和Lipl2l用于制备通用型基因工程疫苗，虽然基因工程疫苗明显优于传统疫苗，但亦存在免疫效果差、抗原单一且成本较高的问题。病原微生物蛋白抗原分子中抗原表位（epitope）与高分子核心载体人工交联而成的多抗原肽（multipleantigenicpeptide，MAP）疫苗可弥补了通用型基因工程疫苗的一些不足，能有效诱导细胞免疫，减少了疫苗毒副作用，提高了安全性，增强了免疫针对性。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术设计的目的在于提供一种问号钩端螺旋体MAP疫苗的制备方法。本专利技术通过以下技术方案加以实现：所述的一种问号钩端螺旋体MAP疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）选择钩体4种蛋白的6个表位设计T-B联合多价抗原表位融合基因，经合成后插入pET-28a表达载体构建以E.coliBL21表达宿主菌的工程菌，IPTG诱导表达，纯化处理，得到多价抗原表位rLLGL蛋白；2）采用中空纤维超滤器收集Ni-NTA亲和层析法提纯后的T-B联合多价抗原表位rLLGL蛋白，碳二亚胺活泼酯法封闭T-B联合多价抗原表位氨基，然后通过其羧基与Poly-Asp-Lys交联，采用中空纤维超滤器收集T-B表位-Poly-Asp-Lys交联物；3）将步骤2）收集的T-B表位-Poly-Asp-Lys交联物与氢氧化铝佐剂混合后形成多抗原肽MAP疫苗。所述的一种问号钩端螺旋体MAP疫苗的制备方法，其特征在于步骤1）中4种单位的6个表位分别为LipL21蛋白的97-122和176-184位氨基酸构成的表位、LipL32蛋白的133-160和221-247位氨基酸构成的表位、GroEL蛋白的215-247位氨基酸构成的表位、Loa22蛋白的22-90位氨基酸构成的表位。所述的一种问号钩端螺旋体MAP疫苗的制备方法，其特征在于步骤2）中LLGL多价表位基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术MAP疫苗免疫金地鼠观察其对问号钩体赖株感染的保护率，MAT检测动物保护试验中存活的MAP疫苗免疫金地鼠心脏采血分离血清与我国钩体标准参考株的凝集效价。结果成功构建了多表位融合基因的原核表达系统，表达产物的相对分子质量约为18.5×103，且主要以可溶性形式存在；rLLGL与Poly-Asp-Lys交联成rLLGL交联体，rLLGL交联体兔抗血清免疫双扩散效价为1：8，该抗血清能与我国15群的钩体标准参考株发生凝集反应，ELISA证明rLLGL交联体能检测不同群型钩体感染患者血清中的抗钩体抗体。100μg和200μg的MAP疫苗对金地鼠的免疫保护率分别为60％和90％。制备的MAP疫苗免疫金地鼠血清可不同程度地凝集各问号钩体血清群。本专利技术成功构建了包含钩体LipL32、OmpLl和LipL21蛋白的优势T和B细胞联合表位基因及其原核表达系统rLLGL，交联成rLLGL交联体具有良好的抗原性和交叉免疫反应性，制备MAP疫苗可作为通用型问号钩体基因工程疫苗。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。实施例1：表位预测及鉴定根据我国钩体血清群型参考标准株lipL21、lipL32、groEL和loa22基因序列获得的蛋白一级结构序列，应用PropredHLA-DRbindingpeptideprediction-ProPred服务器和EMBOSS软件包中ANTIGENIC程序分别预测其T细胞表位和B细胞表位。将预测的表位序列克隆到噬菌体载体M13KE使其展示在PⅢ蛋白表面，纯化展示产物并进行免疫活性分析，前期研究结果表明LipL21蛋白的97-122和176-184位氨基酸构成的表位、LipL32蛋白的133-160和221-247位氨基酸构成的表位、GroEL蛋白的215-247位氨基酸构成的表位、Loa22蛋白的22-90位氨基酸构成的表位具有强免疫活性，表位序列如表1所示。本研究选择LipL21-97、LipL21-176、LipL32-133、LipL32-221、GroEL-215和Loa22-906个表位串联构成LLGL多价表位。表1筛选的LipL21、LipL32、GroEL和Loa22中的免疫优势T-和B-细胞联合表位表位表位定位氨基酸序列（N→C）LipL21-9797-112ASDVV*KK#M*VGETVESALipL21-176176-184DAL*VA#KAQEVSLipL32-133133-160TW*IRVERMSAI*MPDQIAKAAKAKPV#QKLLipL32-221221-247EV*KGSFVASV#G*LLFPPGIPGVSPLIHSGroEL-215215-247NDPFILIYDKK*ISSM#KDLIHILEKVAQAGKPLV*Loa22-9090-117FSEWSKTNAPVIKE*GLRKLPDSYALEI#T*注：*表示前面锚定MHCⅡ分子；#表示前面绑定B淋巴细胞实施例2：基因合成及表达载体的构建根据LLGL多价表位和组成表位氨基酸序列及表达宿主大肠杆菌偏爱密码子特性确定各表位对应核苷酸序列，各表位之间用柔性肽接头GGGGS核苷酸序列ggtggcggtggcagc连接，在LLGL多价表位编码序列的5'端为限制性内切酶位点EcoRI和起始密码子ATG，3'端依次为限制性内切酶位点BglⅡ、终止密码子TAA和BamHI，委托上海Invitrogen公司合成。LLGL多价表位基因核苷酸序列如下所示。将该合成基因片段通过BamHI和EcoRI酶切并纯化后亚克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中，转化大肠杆菌BL21，构建原核表达系统E.coliBL21pET-28a-LLGL。培养E.coliBL21pET-28a-LLGL工程菌提取质粒测序，LLGL多价表位基因核苷酸序列如SEQIDN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种问号钩端螺旋体MAP疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：/n1）选择钩体4种蛋白的6个表位设计T-B联合多价抗原表位融合基因，经合成后插入pET-28a表达载体构建以

【技术特征摘要】
1.一种问号钩端螺旋体MAP疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）选择钩体4种蛋白的6个表位设计T-B联合多价抗原表位融合基因，经合成后插入pET-28a表达载体构建以E.coliBL21表达宿主菌的工程菌，IPTG诱导表达，纯化处理，得到多价抗原表位rLLGL蛋白；
2）采用中空纤维超滤器收集Ni-NTA亲和层析法提纯后的T-B联合多价抗原表位rLLGL蛋白，碳二亚胺活泼酯法封闭T-B联合多价抗原表位氨基，然后通过其羧基与Poly-Asp-Lys交联，采用中空纤维超滤器收集T-B表位-Poly-Asp-Lys交联物；
3）将步骤2）收集的T-B表位-Pol...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙爱华，严杰，张金良，楼宏强，
申请(专利权)人：杭州医学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33