一种抗达氟沙星单链抗体制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及一种抗达氟沙星单链抗体

【技术实现步骤摘要】
一种抗达氟沙星单链抗体、核酸分子、表达载体、试剂盒


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种抗达氟沙星单链抗体
、
核酸分子
、
表达载体
、
试剂盒
。

技术介绍

[0002]DAN
是治疗畜禽呼吸系统和泌尿系统感染等疾病的理想药物，目前被广泛用于兽医临床治疗
。
该药在吸收后主要以原型药物的形式在肝脏代谢，通过肾脏排出体外
。
然而，滥用该药物会造成其在动物组织及产品中大量残留，残留的
DAN
进入人体后，将会破坏肠道菌群的生态平衡，增加腹泻
、
结肠炎
、
过敏等疾病的发病概率；严重时还会引起呼吸系统
、
消化系统和泌尿系统的不可逆性损害；最为致命的是，无节制地使用抗生素将会逐渐增强致病菌的耐药性，使人类在面对细菌感染时进入无药可用的境地，与此同时还会破坏自然微生态平衡，造成严重的环境污染
。
[0003]目前用于检测
DAN
残留的方法有：微生物法
、
免疫分析法
、
高效液相色谱法
(LC)、
液相色谱
‑
质谱
(LC
‑
MS)
法和酶联免疫吸附分析
(ELISA)。
目前，用于免疫检测的抗体都是单克隆抗体或多克隆抗体
。
单克隆抗体或多克隆抗体的制备必须通过细胞培养获得，整个生产过程复杂，消耗时间长，费用高，且不易进行操作
。
单链抗体是将抗体重链可变区和轻链可变区基因通过一个短肽链连接后融合表达出来的抗体片断，其表达形式主要有融合表达
、
胞内表达和分泌表达三种形式，和完整抗体相比，单链抗体具有以下优点：
1)
分子量小，大小仅为完整抗体的六分之一，免疫原性较低；
2)
组织穿透力强，容易进入实体瘤周围的微循环；
3)
血液清除快，肾脏蓄积很少；
4)
无
Fc
段，非特异结合低；
5)
易于通过基因工程大量生产；
6)
易于基因操作，更易构建重组免疫毒素
。
[0004]因此，创新研发出抗达氟沙星单链抗体，能够进一步促进
DAN
残留的准确
、
高效
、
便捷检测
。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的之一在于提供抗达氟沙星单链抗体，能够特异性结合达氟沙星，应用于达氟沙星药物残留检测
。
[0006]本专利技术的目的之二在于提供抗达氟沙星单链抗体编码基因的核酸分子，用于制备本专利技术提供的单链抗体
。
同时，本专利技术还提供包含该核酸分子的重组载体
、
重组表达系统等用于制备本专利技术提供的单链抗体
。
[0007]另外，本专利技术的目的还在于提供抗达氟沙星单链抗体在检测达氟沙星方面的应用于，具体可以用于制备检测试剂盒的原料，作为检测试剂或者作为载体包被原
。
[0008]为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0009]一种抗达氟沙星单链抗体，由重链可变区
、
连接重链可变区和轻链可变区的短肽
、
轻链可变区依次连接组成，所述重链可变区的氨基酸序列如
SEQ NO.1
所示；轻链可变区的氨基酸序列如
SEQ NO.2
所示
[0010]为了进一步提高单链抗体结合达氟沙星的特异性和亲和力，所述重链可变区自
N
端起第
47
位氨基酸由
Glu
突变为
Tyr
；可选的，所述轻链可变区自
N
端第1位氨基酸由
Asp
突变为
Ile
；进一步可选的，所述轻链可变区自
N
端第
103
位氨基酸由
Cys
突变为
Tyr。
[0011]可选的，所述连接重链可变区和轻链可变区的短肽为
GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。
本专利技术提供的单链抗体的完整氨基酸序列如
SEQ NO.3
所示；更进一步为了提高单链抗体的性能，突变改性后的单链抗体的氨基酸序列如
SEQ NO.4
所示
。
[0012]本专利技术通过基因重组表达的方式制备上述单链抗体，首先根据单链抗体的氨基酸序列设计其编码基因核苷酸序列，作为举例说明，编码上述未突变的单链抗体的核酸分子的核苷酸序列如
SEQ NO.5
所示
。
[0013]具体的，在合成编码基因后，通过酶切连接技术构建重组载体，将重组载体转染
DH5
α
等用于可用于重组蛋白表达的细胞系中构建重组表达系统，用于分泌表达制备上述单链抗体
。
[0014]能够理解的是，上述单链抗体能够应用于检测达氟沙星，可以用于制备达氟沙星检测用免疫试剂盒，一种产品形式为：试剂盒中包括达氟沙星半抗原的酶标记物，上述单链抗体；其中上述单链抗体作为包被原；
[0015]第二种为：试剂盒中包括达氟沙星半抗原与载体蛋白的偶联物
、
上述单链抗体试剂和酶标记抗抗体；其中达氟沙星半抗原与载体蛋白的偶联物作为包被原；
[0016]第三种为：试剂盒中包括达氟沙星半抗原的酶标记物
、
上述单链抗体试剂和抗抗体；其中抗抗体作为包被原；
[0017]第四种为：试剂盒中包括达氟沙星半抗原与载体蛋白的偶联物
、
上述单链抗体的酶标记物；其中达氟沙星半抗原与载体蛋白的偶联物作为包被原；
[0018]第五种为：所述试剂盒包括胶体金试纸，包括样品吸收垫
、
胶体金垫
、
反应膜和吸水垫，其依次连接；胶体金垫包被有胶体金标记的上述单链抗体；所述反应膜上含有检测带和质控带，检测带位置包被有达氟沙星半抗原与载体蛋白的偶联物，质控带位置包被有鼠抗
His
标签单克隆抗体
。
[0019]上述试剂盒还包括标准品溶液
、
洗涤液
、
缓冲液等
。
[0020]本专利技术提供的抗达氟沙星单链抗体
(DAN
‑
scFv)
，具有区别与同类单链抗体的氨基酸序列结构，对达氟沙星具有结合特异性和灵敏性，本专利技术通过
icELISA
检测证实本专利技术提供的单链抗体的半数抑制浓度
(half maximal inhibitory concentration,IC50)
为
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种抗达氟沙星单链抗体，由重链可变区
、
连接重链可变区和轻链可变区的短肽
、
轻链可变区依次连接组成，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如
SEQ NO.1
所示；轻链可变区的氨基酸序列如
SEQ NO.2
所示
。2.
如权利要求1所述的抗达氟沙星单链抗体，其特征在于，所述重链可变区自
N
端起第
47
位氨基酸由
Glu
突变为
Tyr
；可选的，所述轻链可变区自
N
端第1位氨基酸由
Asp
突变为
Ile
；进一步可选的，所述轻链可变区自
N
端第
104
位氨基酸由
Arg
突变为
Tyr。3.
如权利要求1～2任一项所述的抗达氟沙星单链抗体，其特征在于，所述连接重链可变区和轻链可变区的短肽为
GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。4.
一种核酸分子，其特征在于，如权利要1所述的单链抗体的编码基因

【专利技术属性】
技术研发人员：齐永华，岳敏，李明杰，赵威，孙国鹏，郭东光，岳锋，李鹏，王选年，
申请(专利权)人：新乡学院，
类型：发明
国别省市：