一种酶联免疫法检测二噁英所需的单链抗体制备方法技术

一种酶联免疫法检测二噁英所需的单链抗体的制备方法，包括如下步骤，步骤A：活化成半抗原；步骤B：制备免疫原；步骤C：制备包被原；步骤D：得到抗二噁英的噬菌体展示抗体文库；步骤E：得到分离蛋白质的核苷酸序列基因；步骤F：得到单链抗体。本发明专利技术单链抗体的制备方便快捷，生产成本低；检测方法稳定性和可重复性好；不需要放射性同位素标记，更加安全实用，且操作简单，检测成本低而检测速度较快；可根据颜色的变化判断检测样品中的二恶英类化合物的有无，结合酶标仪，检测450nm的吸收值即可进行定量分析；可以利用基因工程技术将单链抗体基因与其他蛋白基因融合表达，比如酶蛋白、荧光蛋白等，实现抗体的直接检测，应用前景广泛。应用前景广泛。应用前景广泛。

【技术实现步骤摘要】
一种酶联免疫法检测二噁英所需的单链抗体制备方法


[0001]本专利技术涉及检测二噁英的材料制备方法
，尤其是一种酶联免疫法检测二噁英所需的单链抗体的制备方法。
技术背景
[0002]二噁英是一种被称为持久性有机污染物(Persistent organic pollutants,简称POPs)的危险化学物质。持久性有机污染物环境中非常难降解，同时可以通过食物链富集和放大，也可以通过大气进行远距离传输，是一类毒性很高的污染物。因为这些污染物难降解、难挥发或半挥发、且易于生物蓄积且毒性高，可以通过环境介质远距离迁移，实验证明二噁英可以损害多种器官和系统，二噁英类化合物化学性质稳定，脂溶性强，进入人体后很难代谢，在人体内富集停留长达十几年之久，在环境中，二噁英可以通过食物链富集，在食物链中的位置越高，二噁英聚积的程度就越高，所以也会对全球人类健康和环境造成风险，POPs污染问题备受各国科学家和政府关注。二噁英化学名二氧杂芑，这类化合物有明显的结构特征，属于氯代化合物。其化学结构中含有两个苯环，或者是一个氧键连结两个苯环。由于氯原子可以在不同的取代位点发生取代反应，同时氯原子的个数也是不确定的，导致二噁英有上百种同分异构体。其中多氯代二苯(PCDDs)75种，多氯二苯并呋喃(PCDFs)135种，还有一些结构与二噁英相似的多氯联苯(PCBs)，这类化合物统称为二噁英(Dioxin)。具体的，有17种(2、3、7、8位被氯取代的)同分异构体被认为对人类和生物危害最为严重。
[0003]为了减少二噁英带来的危害，所以在很多行业都会对相应样品内是否含有二噁英、或者含量多少进行检测。目前，现有的检测技术，一般是通过是采用酶联免疫技术检测二噁英类化学物，其检测过程会采用放射性同位素标记法，该种方法由于技术限制，检测成本高、速度相对慢、检测不方便，且检测稳定性不好，并存在检测重复性差的问题，对二噁英的有效检测带来了不利影响。

技术实现思路

[0004]为了克服现有放射性同位素标记法检测样品二噁英，由于技术所限存在如背景所述弊端，本专利技术提供了在相关流程及原料等共同作用下，制备出的成品作为二噁英类化合物的检测试剂盒，具体检测中结合酶标仪对样品进行二噁英检测，具有成本相对低、检测方便及速度相对快、检测稳定性好优点，并利于重复检测，为二噁英的有效检测起到了有力技术支持的一种酶联免疫法检测二噁英所需的单链抗体的制备方法。
[0005]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是；
[0006]一种酶联免疫法检测二噁英所需的单链抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤，步骤A：首先将2
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羟基
‑
3,7,8
‑
三氯二苯并
‑4‑
二噁英活化成半抗原；步骤B：将半抗原与血蓝蛋白形成的偶联蛋白作为免疫原；步骤C：通过免疫原免疫Balb/c小鼠后测血清效价和IC50值，用2
‑
羟基
‑
3,7,8
‑
三氯二苯并
‑4‑
二噁英与牛血清白蛋白形成偶联蛋白作为包被原；步骤D：选择血清效价和IC50值较高的小鼠，处死小鼠后使用试剂盒提取小鼠脾细胞总
RNA，再逆转录得到cDNA,以cDNA为模板扩增重链可变区、轻链可变区基因，经重叠延伸PCR技术将VH、VL基因随机拼接为单链抗体基因,然后将单链抗体基因与载体pCANTAB5E连接并转化大肠杆菌TG1，即得到抗二噁英的噬菌体展示抗体文库；步骤E：用ELISA方法筛选得到带有特异性的抗二噁英的单链抗体的噬菌体颗粒，通过测序得到了一种分离蛋白质的核苷酸序列基因；步骤F：将步骤E的基因插入到表达载体pET28a，在大肠杆菌BL21中表达，利用表达载体上带有的组氨酸标签标记通过镍柱亲和层析纯化单链抗体蛋白，纯化后的单链抗体蛋白用SDL脱盐至1xPBS中，进而得到单链抗体。
[0007]优选地，所述活化半抗原包括七个分步骤，a:称取2
‑
羟基
‑
3,7,8
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三氯二苯并
‑4‑
二噁英,加入二甲基甲酰胺，使2
‑
羟基
‑
3,7,8
‑
三氯二苯并
‑4‑
二噁英样品充分溶解于二甲基甲酰胺；b:将溶解后的样品放置在磁力搅拌器上，设置磁力搅拌，逐滴加入4
‑
溴丁酸乙酯，加完后继续搅拌2h；c：将样品放置在恒温箱中，设置温度为60℃过夜反应约10小时；d:向反应后的混合物加入的甲醇混合均匀，然后缓慢加入氢氧化钠固体，60℃的反应8小时；e:向反应后的混合物中加入饱和的碳酸氢钠溶解，利用乙酸乙酯萃取，弃去有机相；f:水相用盐酸调pH直至沉淀完全,过滤后沉淀用蒸馏水洗涤三次并蒸干，得到半抗原化合物，称重6.6g。
[0008]优选地，所述步骤a中，2
‑
羟基
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3,7,8
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三氯二苯并
‑4‑
二噁英用量是10g(32.95mmol)，二甲基甲酰胺用量是500mL。
[0009]优选地，所述步骤b中，磁力搅拌器的转速是500rpm，加入的4
‑
溴丁酸乙酯量是12.6g(65mmol)；步骤c中，加入的甲醇量是32mL。
[0010]优选地，所述步骤d中，加入的氢氧化钠固体量是16.25g(406.25mmol)，步骤e中，加入的碳酸氢钠量是5mL、温度25℃；步骤f中，盐酸浓度是0.5M。
[0011]优选地，所述免疫原是采用活泼酯法
[60]将二噁英半抗原与钥孔血蓝蛋白偶联制得，人工抗原化学偶联免疫原包括如下操作步骤，(1):用梅特勒天平称取半抗原，N
‑
羟基磺基琥珀酰亚胺和N,N'
‑
二环己基碳二亚胺；(2):把步骤(1)中各原料溶解于N
‑
N
‑
二甲基甲酰胺中，在温度为30℃的条件下，避光反应18小时；(3):取KLH载体蛋白溶于0.13M碳酸氢钠水溶液，将把步骤(2)中反应后的溶液按照物质的量60：1用蠕动泵逐滴加入到载体蛋白溶液中，并用磁力搅拌器不断搅拌；(4):4℃条件下过夜静置反应16小时；(5):用SDL纯化仪将样品脱盐至1xPBS中获得免疫原。
[0012]优选地，所述步骤(1)中，半抗原用量是38.9mg(0.1mmol)，N
‑
羟基磺基琥珀酰亚胺用量是230mg(0.2mmol)，N,N'
‑
二环己基碳二亚胺(DCC)用量是20.6mg(0.02mmol)。
[0013]优选地，所述步骤(2)中，N
‑
N
‑
二甲基甲酰胺用量是10mL；步骤(3)中，KLH用量是10mg/mL；
[0014]优选地，所述包被原是采用活泼酯法
[60]将二噁英半抗原与牛血清蛋白偶联制得，人工抗原化学偶联包被原所有步骤和人工抗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酶联免疫法检测二噁英所需的单链抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤，步骤A：首先将2
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羟基
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3,7,8
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三氯二苯并
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二噁英活化成半抗原；步骤B：将半抗原与血蓝蛋白形成的偶联蛋白作为免疫原；步骤C：通过免疫原免疫Balb/c小鼠后测血清效价和IC50值，用2
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羟基
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3,7,8
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三氯二苯并
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二噁英与牛血清白蛋白形成偶联蛋白作为包被原；步骤D：选择血清效价和IC50值较高的小鼠，处死小鼠后使用试剂盒提取小鼠脾细胞总RNA，再逆转录得到cDNA,以cDNA为模板扩增重链可变区、轻链可变区基因，经重叠延伸PCR技术将VH、VL基因随机拼接为单链抗体基因,然后将单链抗体基因与载体pCANTAB5E连接并转化大肠杆菌TG1，即得到抗二噁英的噬菌体展示抗体文库；步骤E：用ELISA方法筛选得到带有特异性的抗二噁英的单链抗体的噬菌体颗粒，通过测序得到了一种分离蛋白质的核苷酸序列基因；步骤F：将步骤E的基因插入到表达载体pET28a，在大肠杆菌BL21中表达，利用表达载体上带有的组氨酸标签标记通过镍柱亲和层析纯化单链抗体蛋白，纯化后的单链抗体蛋白用SDL脱盐至1xPBS中，进而得到单链抗体。2.根据权利要求1所述的一种酶联免疫法检测二噁英所需的单链抗体的制备方法，其特征在于，活化半抗原包括七个分步骤，a:称取2
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羟基
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三氯二苯并
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二噁英,加入二甲基甲酰胺，使2
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羟基
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3,7,8
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三氯二苯并
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二噁英样品充分溶解于二甲基甲酰胺；b:将溶解后的样品放置在磁力搅拌器上，设置磁力搅拌，逐滴加入4
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溴丁酸乙酯，加完后继续搅拌2h；c：将样品放置在恒温箱中，设置温度为60℃过夜反应约10小时；d:向反应后的混合物加入的甲醇混合均匀，然后缓慢加入氢氧化钠固体，60℃的反应8小时；e:向反应后的混合物中加入饱和的碳酸氢钠溶解，利用乙酸乙酯萃取，弃去有机相；f:水相用盐酸调pH直至沉淀完全,过滤后沉淀用蒸馏水洗涤三次并蒸干，得到半抗原化合物，称重6.6g。3.根据权利要求2所述的一种酶联免疫法检测二噁英所需的单链抗体的制备方法，其特征在于，步骤a中，2
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【专利技术属性】
技术研发人员：高璐，朱学东，薛永来，吴桂竹，杜道林，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：