一种特异性抗异菌脲的单克隆抗体及其重组表达质粒制造技术

本发明专利技术公开了一种特异性抗异菌脲的单克隆抗体，其重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术又公开了一种抗异菌脲重组全长抗体的表达质粒。将本发明专利技术得到的可变区序列基因分别连接到包含了重链恒定区基因和轻链恒定区基因的表达载体，采用双质粒系统的哺乳动物细胞表达获得了抗异菌脲重组全长抗体。该单克隆抗体的可变区序列可应用于异菌脲重组抗体的长期稳定及大批量生产，为农产品、环境等样品中异菌脲残留免疫检测方法提供了可靠、稳定的核心试剂。稳定的核心试剂。稳定的核心试剂。

【技术实现步骤摘要】
一种特异性抗异菌脲的单克隆抗体及其重组表达质粒


[0001]本专利技术属于基因工程
，尤其是涉及一种特异性抗异菌脲的单克隆抗体及其重组表达质粒。

技术介绍

[0002]异菌脲作为一类高效广谱、接触型二甲酰胺类杀菌剂，被广泛用于防治蔬菜、果树、瓜类等作物的早期落叶病和灰霉病。作为一种接触性杀菌剂，异菌脲主要抑制多种寄生真菌的孢子和菌丝。在农药市场，异菌脲占有很大比例，2011年，异菌脲的全球销售额达到1.15亿美元。在农业生产中，尽管杀菌剂的使用可以带来社会效益的增长，但是其不当使用会导致食品中杀菌剂残留较高，从而影响环境以及危害消费者健康。多项研究表明，异菌脲的残留会严重损害非靶标生物，并且在蜜蜂中会导致活性氧(ROS)的产生，从而导致细胞死亡。同样，在人HepG2细胞中，异菌脲可诱导ROS含量的增加，以及影响丙二醛(MDA)的活性。2008年，异菌脲被列为2类致癌物，根据欧洲食品安全局的一项研究，异菌脲的使用可能会使地下水暴露于超过0.1ppb的限值水平。因此，建立用于异菌脲残留的检测方法至关重要。
[0003]目前，异菌脲的残留分析主要使用仪器分析方法，例如气相色谱法、高效液相色谱法和液相色谱串联质谱法(LC
‑
MS)。但是传统的仪器分析方法都需要对样品进行提取和净化等前处理程序，并且仪器的清理和运行过程漫长，需要专业人员维护，不适合大批量样品的快速筛查，而基于抗原抗体的免疫分析方法如酶联免疫吸附法(ELISA)、金标免疫层析试纸法等，已被广泛用于杀菌剂残留的检测，相比于仪器法，免疫分析方法具有快速、特异、高通量、样品前处理简单等优点。因此，不同的免疫分析方法被广泛应用于杀菌剂的残留检测。无论是何种免疫分析方法，核心的反应元件都是抗体，并且直接影响检测分析方法的灵敏度和特异性，通常，研究人员通过杂交瘤技术获得单克隆抗体，但是杂交瘤细胞在培养传代过程中存在不稳定性的缺点。随着基因工程技术的不断发展，通过从杂交瘤细胞中获取抗体的重轻链基因片段，在哺乳动物细胞中表达重组全长抗体，可以获得与亲本抗体性能接近的重组抗体蛋白。相比于传统的杂交瘤技术制备抗体方法，重组表达体系具有批次间差异小、稳定性高、生产周期短、质粒可以长期保存的优点，对于研发稳定、可靠的农药免疫快速分析方法与技术产品具有重要的现实意义。

技术实现思路

[0004]为了改进现有技术的不足，本专利技术提供了一种灵敏度高、可特异性识别异菌脲农药的单克隆抗体及其重组全长表达质粒。
[0005]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种特异性抗异菌脲的单克隆抗体，重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。
[0006]作为优选，重链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0007]作为优选，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4所示。
[0008]作为优选，轻链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0009]本专利技术还公开了一种抗异菌脲重组全长抗体，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列为如SEQ ID NO:2所示。
[0010]作为优选，所述重链可变区编码基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO:1所示。
[0011]作为优选，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0012]作为优选，所述轻链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0013]本专利技术又公开了一种抗异菌脲重组全长抗体表达质粒，含有上述的重链可变区和小鼠重链IgG1恒定区的核苷酸序列，可以表达抗异菌脲重组全长抗体的重链蛋白；或者，含有上述的轻链可变区和小鼠轻链Kappa恒定区的核苷酸序列，可以表达抗异菌脲农药的重组全长抗体的轻链蛋白。
[0014]本专利技术还公开了一种特异性抗异菌脲单克隆抗体的应用，用于异菌脲残留的快速筛查。
[0015]本专利技术以一株能稳定分泌识别异菌脲的特异性杂交瘤细胞株(克隆编号为1H10)为对象，针对该细胞株完成重链和轻链可变区基因的扩增、测序以及合成。基于同源重组技术分别构建重链、轻链表达载体，双质粒转染至哺乳动物细胞HEK 293(F)，经培养、纯化，获得抗异菌脲的重组全长抗体。以异菌脲作为检测对象，采用ELISA验证抗异菌脲单克隆抗体中可变区序列的准确性，结果证明该重组全长抗体灵敏度与小鼠腹水单抗一致，说明本专利技术中序列的有效性，本专利技术的抗体可变区序列可应用于抗异菌脲重组全长抗体的制备，以及异菌脲残留免疫分析方法的建立。
[0016]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：首次研制了可高灵敏、高特异检测异菌脲的重组全长抗体；本专利技术公开了抗异菌脲的单克隆抗体可变区序列，包含重链可变区和轻链可变区序列；本专利技术采用哺乳动物HEK293(F)细胞重组表达体系验证了可变区序列有效性。通过构建重链基因表达载体(含重链可变区基因和重链恒定区基因)、轻链基因表达载体(含轻链可变区基因和轻链恒定区基因)双质粒，本专利技术获得的重组全长抗体经ELISA验证具有与腹水单克隆抗体相近的灵敏度。该单克隆抗体及其可变区序列可应用于重组抗体的大批量稳定生产，作为可靠、稳定的核心试剂，为异菌脲残留免疫分析方法及技术产品的开发提供了良好的支撑。
附图说明
[0017]图1为本专利技术制备的腹水单克隆抗体和重组全长抗体检测异菌脲的ELISA竞争曲线(异菌脲标准溶液浓度从低到高分别为：20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125ng/mL)。
[0018]图2为本专利技术以反转录获得的cDNA为模板，PCR扩增抗体可变区的琼脂糖凝胶电泳的结果(异菌脲单克隆抗体的轻重链可变区片段大小电泳图)。
[0019]图3为SDS
‑
PAGE检测本专利技术抗体可变区序列在哺乳动物细胞HEK293(F)中的重组全长IgG表达结果(重组表达异菌脲抗体的SDS
‑
PAGE电泳图)。
具体实施方式
[0020]为了使本
的人员更好地理解本专利技术方案，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在
没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本专利技术保护的范围，如无特殊说明，实施例中的实验方法均为常规方法。
[0021]本专利技术涉及一种特异性抗异菌脲的单克隆抗体，其重链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示,轻链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQ ID NO:4所示。该单克隆抗体的可变区序列能应用于重组抗体的大批量生产，为实现异菌脲农药残留快速筛查提供可靠、稳定的核心试剂。
[0022]1.抗异菌脲单克隆抗体的制备及性能表征
[0023]基于传统的杂交瘤技术，本专利技术采用实验室前期制备的异菌脲人工抗原，经小鼠免疫、细胞融合以及本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种特异性抗异菌脲的单克隆抗体，其特征在于：重链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO:2所示。2.根据权利要求1所述的抗异菌脲单克隆抗体，其特征在于：重链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。3.根据权利要求1或2所述的抗异菌脲单克隆抗体，其特征在于：轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4所示。4.根据权利要求3所述的抗异菌脲单克隆抗体，其特征在于：轻链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。5....

【专利技术属性】
技术研发人员：郭逸蓉，陆昕颖，赵莉，邹茹冰，马琳，方一画，朱国念，
申请(专利权)人：上海市农业技术推广服务中心，
类型：发明
国别省市：