本发明专利技术涉及一种采用复合酶法提取金银花中绿原酸的方法，本发明专利技术研究了纤维素酶与果胶酶复合酶法提取金银花中主要药用有效成分绿原酸的新工艺，通过单因素试验和正交试验，优化出复合酶法提取金银花中绿原酸的最佳工艺条件：酶解温度４５℃，ｐＨ４．５，纤维素酶与果胶酶复合比为１．０∶０．３，酶解时间１．５小时。本发明专利技术的试验结果表明，该工艺重复性好，结果稳定。应用复合酶酶法新工艺提取金银花中绿原酸，绿原酸提取率可达８３．０６％，比传统水提工艺绿原酸提取率提高１６．９３％。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于中药材提取
，涉及从具有清热解毒和抗菌消炎的金银花中提 取药用有效成分绿原酸的新工艺。更具体的说是通过单因素试验和正交试验，优化出复合 酶法提取金银花中绿原酸的最佳工艺。
技术介绍
金银花为忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb)的干燥花蕾或带初开的 花，为常用清热解毒和抗菌消炎的中药材之一(芦绪芳.金银花的研究现状.时珍国医 国药，2006，17 (5) :843-844)。其化学成分为绿原酸、异绿原酸、挥发油、咖啡酸、黄酮类化合 物、三萜皂苷、木犀草素等(吴晓春，杨苏亚.金银花的成分及药理作用分析.青海医药 杂志，2007，37(5) :88-89)。其中绿原酸是金银花的主要药效活性成分，用来评价金银花的 质量。 绿原酸是胞内物质，其细胞壁主要由纤维素组成，纤维素酶是可将纤维素水解成 水溶性糖的复合酶类。(刘翔，何国庆.纤维素酶及相关酶在食品生物技术中的应用. 粮油加工与食品机械，2006，06 :61-63 ；向智男，宁正祥.金银花中绿原酸的提取及纯化方 法比较.林产化学与工业，2006，26(1) :116-120)。绿原酸的药理作用绿原酸的主要药 理作用为抗菌消炎和抗病毒，此外还具有保护心血管的活性。金银花用纤维素酶处理后，细胞壁中的纤维素被水解成水溶性的糖类物质，而细 胞壁的水解破裂有利于胞内物质的溶出，因而酶法提取能提高绿原酸的提取率。目前文献 报道的金银花中绿原酸的提取工艺有主要有水煎法、酸碱浸提法，乙醇回流法等，利用简 单的物理方法提取金银花中的有效成分绿原酸，但上述方法存在着提取率较低、成本较高 且造成环境污染等问题；而近来利用超声波法、超临界CO2萃取等新型物理仪器提取绿原酸 的方法，因提取效率较高而受到广泛关注，但由于在生产中存在投资过大，操作繁琐等问题 而限制了上述方法在工业生产中的普及使用。
技术实现思路
本专利技术针对目前金银花中提取绿原酸工艺中存在的缺点与不足，提出采用纤维素 酶与果胶酶的复合酶法新工艺提取绿原酸，考察了酶的用量、酶解时间、酶解温度及纤维素 酶与果胶酶复合比等影响因素，优化出了纤维素酶与果胶酶复合酶法提取最佳工艺条件。 采用《中国药典》2005版HPLC法测定绿原酸含量，计算绿原酸提取率。纤维素酶与果胶酶 复合酶新工艺提取金银花中绿原酸，比传统水提工艺提高了 16. 93%的提取率。为达到上述 目的，本专利技术提供如下的技术方案，其特征在于按如下的步骤进行(1)按照200_400U/g药材加入复合酶，控制酶解温度在40°C -45 °C，pH值 4. 5-5. 0，酶解时间1-2小时，处理金银花；其中所述的复合酶为纤维素酶与果胶酶混合物；(2)酶解完成后，按药材重量10倍量加入70-90°C水，浸提2_3次，每次l_3h小时，合并浸出液，减压浓缩；(3)将浓缩液溶于50%甲醇溶液中，定容至50mL，精密吸取ImL用50%甲醇溶液定容至IOOmL,以HPLC法测定绿原酸含量，计算绿原酸提取率；其中纤维素酶与果胶酶复合 比为 1. 0 0. 1-0. 3。本专利技术所述的采用复合酶法提取金银花中绿原酸的方法，其中纤维素酶的最适合 酶活力为pH值4. 5，最适温度为40°C，添加量为200U/g药材；果胶酶的最适合酶活力为pH 值5.0，最适温度为45°C，添加量为400U/g药材；纤维素酶与果胶酶复合比为1.0 0.3。 本专利技术的具体试验方法如下2.方法与结果1.仪器与试剂高效液相色谱仪 Shimadzu LC-2010A，包括四元输液泵、在线真空脱气机、自动进样器、柱温箱，紫外检测器LCsolution色谱工 作站电子天平Sartorius BP211D，精密度万分之一旋转蒸发仪无锡市星海王生化设备有限公司，规格R20升恒温水浴锅河南豫华仪器有限公司，型号97冊绿原酸标准品 中国药品生物制品检定所，批号110753_200413酶纤维素酶(40000U)、果胶酶(30000U)天津利华酶制品厂批号20091016金银花药材 天津中新药业集团中新制药厂提供2.1标准曲线的绘制根据《中国药典》2005版金银花项下绿原酸含量测定方法，色谱条件为，检测波 长327nm ；柱温35°C ；流动相乙腈-0. 4%磷酸溶液(13 87)。精密称取绿原酸标准品 11.76mg，用50%的甲醇溶液溶解，定容至50mL。精密量取2mL置于IOmL棕色容量瓶中， 用50%甲醇定容至刻度，配制成浓度为0. 04704mg/mL的溶液，即得(2_8°C下保存)。分别 精密吸取标准品溶液2 μ L，4 μ L，6 μ L，8 μ L，10 μ L，12 μ L，14 μ L，16 μ L，按上述色谱条件 测定峰面积，以峰面积Y为纵坐标，以进样量X为横坐标进行回归分析，得到回归方程y = 146357x+9663，R2 = 0.9998。表明绿原酸含量在0. 0941-0. 7526 μ g范围内线性关系良好。2. 2金银花药材中绿原酸含量测定取金银花药材，粉碎，精密称取过四号筛粉末0. 5g，置具塞锥形瓶中，精密加入 50 %甲醇50mL，称定重量，超声处理(功率250w，频率35kHZ) 30min,放冷，再称定重量，用 50%甲醇补足减失的重量，摇勻滤过，精密量取续滤液5mL，置25mL棕色容量瓶中，加50% 甲醇定容至刻度，摇勻，即得。精密吸取5-10 μ L注入液相色谱仪并测定绿原酸含量为 2. 34%。2. 3水提取金银花中绿原酸工艺试验精密称取金银花药材5g，加入10倍量的水，70°C回流提取2小时，滤过；再加入8 倍量的水，70°C回流提取2小时，滤过，合并两次水提取液，减压浓缩，再将浓缩液溶于50% 甲醇溶液中，定容至50mL，精密吸取ImL用50%甲醇溶液定容至lOOmL，HPLC法测定绿原酸 含量为2. 34%，计算水提工艺绿原酸提取率为66. 13%。2. 4复合酶法提取金银花中绿原酸工艺试验2. 4. 1复合酶法提取工艺条件的单因素考察2. 4. 1. 1酶解温度对绿原酸提取率的影响精密称取过四号筛金银花药材粉末5g，按照200U/g药材，加入纤维素酶，将酶溶 于10倍量药材粉末的水溶液中，调节PH5.0的，不同温度条件下酶解lh，酶解温度分别为 30、35、40、45、50、551，再加水701浸提两次，111/次，加水量为药材的10倍，合并浸出液于 旋转蒸发仪减压浓缩，再将浓缩液溶于50%甲醇溶液中，定容至50mL，精密吸取ImL用50% 甲醇溶液定容至IOOmL,以HPLC法测定绿原酸含量为2. 34%，计算绿原酸提取率，结果见图Io试验结果显示，酶解温度为40°C时，绿原酸提取率最高。分析试验结果随着酶解 温度从30-35°C的增加，酶的活力逐渐增加，绿原酸的提取率也逐渐增加；40°C是纤维素酶 的最适温度，酶的活力最大，所以40°C绿原酸提取率最高；但是再增加酶解温度，绿原酸提 取率不再增加，反而下降，分析原因是再增加酶解温度，纤维素酶活力逐渐下降所致。2. 4. 1. 2酶解pH对绿原酸提取率的影响精密称取过四号筛金银花药材粉末5g，按照200U/g药材，加入纤维素酶，将酶溶 于10倍量药材粉末的水溶液本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种采用复合酶法提取金银花中绿原酸的方法，其特征在于按如下的步骤进行： （１）按照２００－４００Ｕ／ｇ药材加入复合酶，控制酶解温度在４０℃－４５℃，ｐＨ值４．５－５．０，酶解时间１－２小时，处理金银花；其中所述的复合酶为纤维素酶与果胶酶混合物； （２）酶解完成后，按药材重量１０倍量加入７０－９０℃水，浸提２－３次，每次１－３ｈ小时，合并浸出液，减压浓缩； （３）将浓缩液溶于５０％甲醇溶液中，定容至５０ｍＬ，精密吸取１ｍＬ用５０％甲醇溶液定容至１００ｍＬ，以ＨＰＬＣ法测定绿原酸含量，计算绿原酸提取率；其中纤维素酶与果胶酶复合比为１．０∶０．１－０．３。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：凌宁生，郑丽娜，王岩，
申请(专利权)人：天津中新药业集团股份有限公司中新制药厂，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]
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