本发明专利技术公开了一种利用微生物发酵对猪去氧胆酸A环进行转化后的中间体，采用恶臭假单胞菌ATCC 02842作为菌种，采用猪去氧胆酸作为底物，经发酵制备后，将猪去氧胆酸的3号位羟基脱氢氧化成酮基，在A环1,2位和4,5位脱氢形成两个双键，同时将C17位尾部脂肪侧链由原来的4个碳原子缩短为2个碳原子。本发明专利技术利用微生物转化技术，将来源丰富、价格低廉的猪去氧胆酸转化为经济价值、药物价值都较高的有机化合物或中间体，为生物合成领域提供了一种新型甾体类化合物的A环结构。类化合物的A环结构。类化合物的A环结构。
【技术实现步骤摘要】
利用微生物发酵对猪去氧胆酸A环进行转化后的中间体
[0001]本专利技术属于微生物转化
，具体的涉及一种利用微生物发酵对猪去氧胆酸A环进行转化后的中间体。
技术介绍
[0002]众所周知，甾体化合物的A环在甾体母核结构中起着重要的作用，如甾体化合物A环的结构对研究抗风湿、麻痹及抗肿瘤等药物起着至关重要的作用，许多孕激素类药物及抗癌药物等也是通过对甾体类化合物A环结构进行改造得以实现的。目前甾体类药物的合成方法主要分为化学方法和生物方法，化学方法存在易对环境造成污染，合成工艺复杂，且某些化合物难以合成的缺点；生物转化由于其转化步骤少，转化率高，副产物少，对环境危害小等优点受到了国内外学者的广泛研究。
[0003]猪去氧胆酸（HDCA）属于一种常用的甾体化合物，其结构特点为：C3位羟基在α位，C6 位羟基为β位，C10和 C13位点上的取代基为角甲基，C17 位点连接一个脂肪侧链；又由于猪去氧胆酸的来源丰富、价格低廉，因此利用微生物转化技术将其转化为经济价值和药物价值都较高的有机化合物或药用中间体，不仅能大大降低药物的原料成本，还能为生物合成领域研发一种新型甾体类化合物的A环结构。
技术实现思路
[0004]针对上述问题，本专利技术旨在提供一种利用微生物发酵对猪去氧胆酸A环进行转化后的中间体，利用微生物转化技术将来源丰富、价格低廉的猪去氧胆酸（HDCA）转化为经济价值、药物价值较高的有机化合物或中间体。
[0005]本专利技术采用如下技术方案实现：一种利用微生物发酵对猪去氧胆酸A环进行转化后的中间体，采用恶臭假单胞菌ATCC 02842作为菌种，采用猪去氧胆酸作为底物，经发酵制备后，将猪去氧胆酸的3号位羟基脱氢氧化成酮基，在A环1,2位和4,5位脱氢形成两个双键，同时将C17位尾部脂肪侧链由原来的4个碳原子缩短为2个碳原子，所述中间体结构式如下：。
[0006]进一步地，上述中间体的发酵转化步骤如下：（1）菌种的活化和种子液培养；（2）发酵转化；
（3）转化产物分离提取。
[0007]进一步地，步骤（1）中所述的菌种为外购的恶臭假单胞菌ATCC 02842。
[0008]进一步地，步骤（1）中所述菌种的活化，是取菌种恶臭假单胞菌ATCC 02842冻存的甘油管，用接种环接种于LB平板中，于28℃培养箱中恒温培养24h。
[0009]进一步地，步骤（1）中所述种子液培养，是选用SX液体培养基，配制100ml SX液体培养基于500ml锥形瓶中，在121℃温度下灭菌30min，然后取步骤（1）中接种了恶臭假单胞菌ATCC 02842的LB平板，用接种环挑取平板上的单菌落接种于SX液体培养基中，于28℃恒温摇床振荡培养16h。
[0010]进一步地，步骤（2）中所述发酵转化，是选用SX液体培养基作为发酵培养基，将发酵培养基配好后在发酵罐内121℃灭菌30min，冷却至室温后加入步骤（1）中的种子液，于28℃恒温发酵48h。
[0011]进一步地，步骤（1）中所述LB固体培养基成分包括蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL、琼脂粉20g，pH为7.0。
[0012]进一步地，步骤（2）中所述发酵转化的培养基配方为猪去氧胆酸 3g、硫酸铵1g、磷酸二氢钾1g、磷酸氢二钾1g、氯化钠0.5g、硫酸锌0.02g、硫酸亚铁0.01g、蒸馏水1000mL，且培养基的PH值为7.5，其中猪去氧胆酸用0.45μm滤头过滤出菌。
[0013]进一步地，步骤（3）中所述转化产物的分离提取，是将步骤（2）所得的发酵液用高速冷冻离心机8000rpm离心收集上清，然后将上清液于旋蒸仪旋蒸浓缩，浓缩后用稀盐酸酸化，酸化后用高速离心机10000rpm离心分离产物和水，得到产物后再次加水离心一次，将产物用勺子刮出自然干燥得到粗产物，粗产物为黄褐色粉末。
[0014]进一步地，将上述粗产物通过制备液相进行分离纯化得到中间体，中间体外观为白色粉末。
[0015]本专利技术的有益效果在于：利用转化步骤少，转化率高，副产物少，对环境危害小的微生物转化技术，将来源丰富、价格低廉的猪去氧胆酸（HDCA）转化为经济价值、药物价值都较高的有机化合物或中间体。同时，还为生物合成领域提供了一种新型甾体类化合物的A环结构。
附图说明
[0016]图1为菌株ATCC 02842转化HDCA的TLC结果分析图；图2为HDCA对照HPLC图；图3为菌株ATCC 02842对HDCA48h转化产物HPLC图；图4为中间体HPLC图。
实施方式
[0017]下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
实施例
[0018]本实施例中的菌种采用外购的恶臭假单胞菌ATCC 02842；本实施例中选用的SX液体培养基的成分如下述表1所示：表 1 SX培养基成分浓度（g/L）KH2PO41.0K2HPO41.0(NH4)2SO41.0ZnSO4
·
7H2O0.02FeSO4·
7H2O0.02NaCl0.05HCA3；本实施例中选用的LB固体培养基的成分如下述表2所示：表 2 LB培养基成分浓度（g/L）蛋白胨10.0酵母膏5.0氯化钠5.0
[0019]本实施例中间体的发酵转化步骤如下：（1）菌种的活化；根据表2中的成分配制LB固体培养基，取菌种恶臭假单胞菌ATCC 02842冻存的甘油管，用接种环接种于LB平板中，置于28℃培养箱中恒温培养24h。
[0020]（2）种子液培养；根据表1中的成分配制100ml 的SX液体培养基于500ml锥形瓶中，在121℃温度下灭菌30min；取步骤（1）中接种了恶臭假单胞菌ATCC 02842的LB平板，用接种环挑取平板上的单菌落接种于SX液体培养基中，于28℃恒温摇床振荡培养16h。
[0021]（3）发酵转化；根据表1中的成分配制10L 的SX液体培养基，放置在发酵罐内121℃灭菌30min，待培养基冷却至室温后加入步骤（2）中培养好的种子液300mL，28℃恒温发酵48h。
[0022]（4）转化产物的分离提取先将步骤（3）所得的发酵液用高速冷冻离心机8000rpm离心收集上清，然后将上清液于旋蒸仪旋蒸浓缩，浓缩后用稀盐酸酸化，酸化后用高速离心机10000rpm离心分离产物和水，得到产物后再次加水离心一次，将产物用勺子刮出自然干燥得到黄褐色的粗产物。
[0023]将所得粗产物溶于甲醇并在制备液相中分离提纯得到本专利技术的中间体，中间体外观为白色粉末。
[0024]将实施例一中的转化产物进行TLC和HPLC检测，检测分析方法如下：（1）薄层色谱（TLC）法分析
薄层色谱法是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，也用于跟踪反应进本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.利用微生物发酵对猪去氧胆酸A环进行转化后的中间体，其特征在于，采用恶臭假单胞菌ATCC 02842作为菌种，采用猪去氧胆酸作为底物，经发酵制备后，将猪去氧胆酸的3号位羟基脱氢氧化成酮基，在A环1,2位和4,5位脱氢形成两个双键，同时将C17位尾部脂肪侧链由原来的4个碳原子缩短为2个碳原子，所述中间体结构式如下：。2.如权利要求1所述的利用微生物发酵对猪去氧胆酸A环进行转化后的中间体，其特征在于，所述中间体的发酵转化步骤如下：（1）菌种的活化和种子液培养；（2）发酵转化；（3）转化产物分离提取。3.如权利要求2所述的利用微生物发酵对猪去氧胆酸A环进行转化后的中间体，其特征在于，步骤（1）中所述的菌种为外购的恶臭假单胞菌ATCC 02842。4.如权利要求3所述的利用微生物发酵对猪去氧胆酸A环进行转化后的中间体，其特征在于，步骤（1）中所述菌种的活化，是取菌种恶臭假单胞菌ATCC 02842冻存的甘油管，用接种环接种于LB平板中，于28℃培养箱中恒温培养24h。5.如权利要求2所述的利用微生物发酵对猪去氧胆酸A环进行转化后的中间体，其特征在于，步骤（1）中所述种子液培养，是选用SX液体培养基，配制100ml SX液体培养基于500ml锥形瓶中，在121℃温度下灭菌30min，然后取步骤（1）中接种了恶臭假单胞菌ATCC 02842的LB平板，用接种环挑取平板上的单菌落接种于SX液体培养基中，于28℃恒温摇床振荡培养16h。6.如权利要求2所述的利用微生物发酵对猪去氧...
【专利技术属性】
技术研发人员：邓家国，欧阳文凯，李国军，谢小国，李跃忠，盛敏，曾飞，洪媛，文静，覃玉浓，胡海波，
申请(专利权)人：常德云港生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。