基于MDC-FFFISH-FACS定向分离土壤中目标微生物的方法技术

一种基于MDC

【技术实现步骤摘要】
基于MDC
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FFFISH
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FACS定向分离土壤中目标微生物的方法


[0001]本专利技术涉及的是一种微生物检测领域的技术，具体是一种单细胞水平基于膜扩散室
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无固定荧光原位杂交
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荧光激活细胞分选(MDC
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FFFISH
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FACS)定向分离土壤中目标微生物的方法。

技术介绍

[0002]自然界中存在大量稀有或尚未培养的微生物，基于传统的分离培养方法分离特定的微生物具有盲目性，利用荧光原位杂交技术可以标记特定的微生物，其难点在于目标微生物的探针设计，通常数据库(Probe Base)里的探针种类有限且特异性相对较差。利用密度梯度离心法或梯度离心法从土壤样品中提取微生物细胞的数目相对较少，容易漏掉稀少的细胞，如何提取尽可能多的微生物细胞对不漏掉稀少微生物细胞十分关键，另外，为能够分选到稀少微生物细胞，分选前对稀少微生物细胞进行富集十分必要。除此之外，目前缺少将目标微生物的富集、标记、分选集成一体的方法，如何高效、定向分离目标微生物是当前亟需解决的问题。

技术实现思路

[0003]本专利技术针对现有技术存在的上述不足，提出一种基于MDC
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FFFISH
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FACS定向分离土壤中目标微生物的方法，为单细胞测序获得未培养微生物基因组揭示功能提供材料，从而使未培养的微生物可以更高效的被获得和研究，集富集、标记、分选于一体，可以准确标记并分离到目标微生物。
[0004]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0005]本专利技术涉及一种基于MDC
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FFFISH
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FACS定向分离土壤中目标微生物的方法，通过膜扩散(MDC)方式富集目标微生物，根据其16S rRNA基因序列设计寡核苷酸探针，按照无固定的荧光原位杂交(FFFISH)方式对目标微生物进行杂交，最后采用荧光激活流式细胞仪(FACS)对目标微生物进行单细胞分离。
[0006]所述的目标微生物，通过将待测土壤加入PBS中并加入焦磷酸钠，经涡旋处理和离心后的上清液合并后进一步离心处理后弃上清，重复三次，将沉淀重悬在PBS中，并加入碘海醇溶液，再经离心后将得到的最上层溶液即包含目标微生物。
[0007]优选地，使用SYTO
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9荧光染料进行染色，在共聚焦荧光显微镜下观察，并通过流式细胞仪进行计数。
[0008]所述的膜扩散方式富集目标微生物是指：在组织培养插入物(TCI)中填充目标微生物的固体培养基，并在该固体培养基中加入土壤提取液，待凝固后，将TCI倒置放在无菌六孔板中；将上述得到的微生物细胞过滤到0.22μm的聚碳酸酯膜上，将接种目标微生物的聚碳酸酯膜放置在0.4μm无菌TCI的顶部，将培养容器在适宜温度下避光孵育。
[0009]所述的土壤提取液，通过以下方式得到：在10g采集到的土壤中加入100ml的蒸馏水，超声30min，121℃高温高压灭菌20min，待溶液冷却后，静置20min，使用0.22μm的滤膜过
滤，得到的滤液即为土壤提取液。
[0010]所述的设计寡核苷酸探针是指：为提高探针的特异性，在目标微生物的两个可变区设计探针，首先，使用MEGA
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X将目标微生物的16S r RNA基因序列与同属微生物的16S r RNA基因序列进行对齐，找到目标微生物16S rRNA基因序列的V3区，设计具有简并碱基的寡核苷酸探针，将该探针在数据库中(NCBI、RDP、SILVA)比对，检验探针的特异性，当比对结果都是同属的微生物序列则认为该探针特异性良好，将该探针的5
’
端进行CY3修饰，之后在该探针的上下游分别设计一个19bp的辅助探针，用于打开发夹结构。同理，设计V4区的寡核苷酸探针，将该探针的5
’
端进行Alexa Fluor488修饰，同样在该探针的上下游分别设计一个19bp的辅助探针。
[0011]所述的无固定的荧光原位杂交方式对目标微生物进行杂交是指：将膜扩散方法富集后的微生物洗脱到无菌水中，加入50μl的杂交缓冲液和目标微生物的寡核苷酸探针，在46℃杂交后，12000rpm离心2min，去除杂交缓冲液，加入48℃预热的500μl洗涤缓冲液洗涤20min，最后使用500μl冰冷的1
×
PBS洗涤两次，重悬在500μl的1
×
PBS中，该过程会优化甲酰胺浓度、探针终浓度和杂交时间。
[0012]所述的单细胞分离，采用FACS仪器将FFFISH双标记的细胞采用单细胞分选模式分选到每个孔中；分选完成后，将多孔板在
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80℃下反复冻融后再在65℃环境下孵育以裂解微生物细胞；孵育完成后依次加入终止反应液、反应缓冲液和Phi29聚合酶，混匀后加热并终止反应。
[0013]所述的单细胞分离，优选在终止反应后将混匀后的MDA产物稀释100倍后作为DNA模板进行PCR测序，将拼接后的测序结果进行比对，根据种属信息确定是否为目标微生物。技术效果
[0014]本专利技术通过目标微生物的富集、标记、分选一体的流程，土壤样品的预处理方法及目标微生物的探针设计，能够高效和定向分离目标微生物。
附图说明
[0015]图1为本专利技术MDC
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FFFISH
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FACS的流程图；
[0016]图2为本专利技术土壤样品预处理的流程图；
[0017]图3为本专利技术设计寡核苷酸探针的示意图；
[0018]图4为本专利技术基于MDC
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FFFISH
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FACS定向分离土壤中大肠杆菌时使用共聚焦荧光显微镜直观观察单独密度梯度离心法和联合物理化学方法密度梯度离心方法提取的微生物细胞的结果图；
[0019]图中：(A)单独密度梯度离心法提取的微生物数目；(B)联合化学物理方法提取的微生物数目；
[0020]图5为本专利技术基于MDC
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FFFISH
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FACS定向分离土壤中大肠杆菌时使用流式细胞仪定量分析单独密度梯度离心法和联合物理化学方法密度梯度离心提取的微生物细胞数目的结果图；
[0021]图中：(a
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c)单独密度梯度离心法提取的微生物数目,三次重复；(d
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f)联合化学物理方法提取的微生物数目，三次重复。
具体实施方式
实施例1
[0022]如图1所示，为本实施例涉及一种基于MDC
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FFFISH
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FACS定向分离土壤样品中大肠杆菌的方法，包括：
[0023]步骤1)如图2所示，MDC方法将微生物细胞与土壤颗粒分离并富集土壤中大肠杆菌：首先在3g土壤中加入30ml的1
×
PBS溶液，然后加入0.3％的焦磷酸钠，混匀，加入100μl的OD
600
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于MDC
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FFFISH
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FACS定向分离土壤中目标微生物的方法，其特征在于，通过膜扩散(MDC)方式富集目标微生物，根据其16S rRNA基因序列设计寡核苷酸探针，按照无固定的荧光原位杂交(FFFISH)方式对目标微生物进行杂交，最后采用荧光激活流式细胞仪(FACS)对目标微生物进行单细胞分离。2.根据权利要求1所述的基于MDC
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FFFISH
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FACS定向分离土壤中目标微生物的方法，其特征是，所述的目标微生物，通过将待测土壤加入PBS中并加入焦磷酸钠，经涡旋处理和离心后的上清液合并后进一步离心处理后弃上清，重复三次，将沉淀重悬在PBS中，并加入碘海醇溶液，再经离心后将得到的最上层溶液即包含目标微生物。3.根据权利要求2所述的基于MDC
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FFFISH
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FACS定向分离土壤中目标微生物的方法，其特征是，使用SYTO
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9荧光染料进行染色，在共聚焦荧光显微镜下观察，并通过流式细胞仪进行计数。4.根据权利要求1
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3中任一所述的基于MDC
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FFFISH
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FACS定向分离土壤中目标微生物的方法，其特征是，所述的膜扩散方式富集目标微生物是指：在组织培养插入物(TCI)中填充目标微生物的固体培养基，并在该固体培养基中加入土壤提取液，待凝固后，将TCI倒置放在无菌六孔板中；将上述得到的微生物细胞过滤到聚碳酸酯膜上，将接种目标微生物的聚碳酸酯膜放置在无菌TCI的顶部，将培养容器在适宜温度下避光孵育。5.根据权利要求4所述的基于MDC
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FFFISH
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FACS定向分离土壤中目标微生物的方法，其特征是，所述的土壤提取液，通过以下方式得到：在采集到的土壤中加入蒸馏水，超声后高温高压灭菌，待溶液冷却后，静置并滤膜过滤，得到的滤液即为土壤提取液。6.根据权利要求1所述的基于MDC
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FFFISH
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FACS定向分离土壤中目标微生物的方法，其特征是，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：李志勇，张密密，王新宇，申洁，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：